作为泛素特异性蛋白酶19(USP19)抑制剂的药物化合物的制作方法

本发明涉及泛素特异性蛋白酶19(usp19)抑制剂及其使用方法。

背景技术：

1、在过去十年中，蛋白泛素化已成为重要的翻译后修饰，在多种细胞过程(包括蛋白水解、基因表达、dna修复、免疫反应、代谢或细胞周期调节)中发挥作用。泛素蛋白酶体系统(ups)的失调也与多种人疾病的发病机制有关，这些人疾病包括但不限于癌症(hoeller d.等人,自然癌症综述(nat.rev.cancer)(2006),6,776-788)、病毒感染(gao等人,生理药理学杂志(j.physiol.,pharmacol.)(2006),84,5-14)、代谢或神经退行性病症(loosdregtj.等人,免疫(immunity)(2013),39,259-271；rubinsztein d.等人,自然(nature)(2006),443,780-786)以及免疫和炎症相关的医学病况(wang j.等人,细胞免疫学杂志(j.cellimmunol.)(2006),3,255-261；corn j.等人,自然结构和分子生物学(nat.struct.&mol.biol.)(2014),21,297-300；nicholson b.等人,细胞生物化学与生物物理学(cellbiochem.biophys.)(2013),60,61-68)。

2、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)或(卡非佐米)获批和临床成功用于治疗套细胞淋巴瘤(aml)和多发性骨髓瘤(mm)验证了ups作为适合药物干预的癌症靶标。尽管有效，但由于选择性差和急性毒性问题，它们的临床应用受到严重限制。目前的蛋白酶体抑制剂通过抑制26s蛋白酶体，无差别地损害癌细胞和正常细胞中的蛋白水解作用，并且具有治疗指数低的特点。为了解决这个问题，有前景的可选方法可能靶向蛋白酶体上游的ups。干扰泛素(ub)缀合/解缀合机制，例如在泛素特异性蛋白酶(usp)水平上，将实现开发具有增强特异性和降低毒性特征的改进疗法。

3、usp是去泛素化酶(dub)家族中最大的亚家族，迄今为止已报道有超过60个家族成员(komander d.等人,自然分子综述(nat.rev.mol).(2009),10,550-563；clague m.等人,生理学综述(physiol.rev.)(2013),93,1289-1315)。usp通常是半胱氨酸蛋白酶，其催化从特异性靶底物去除ub，从而防止它们被蛋白酶体诱导的降解，或调节它们的激活和/或亚细胞定位(colland f.等人,生物化学(biochimie)(2008),90,270-283；nicholson b.等人,细胞生物化学与生物物理学(cell biochem.biophys.)(2013),60,61-68)。现已明确，usp调节参与人疾病发病机制的众多蛋白(包括癌基因和肿瘤抑制因子)的稳定性和激活。因此，usp代表药物干预的新兴且有吸引力的靶向类别。

4、在所有usp中，usp19是重要成员，因为它与许多对病理病况(包括但不限于癌症、神经退行性和退行性疾病以及抗病毒免疫应答)有影响的重要途径相关。usp19表达为长度从71.09kda(同种型2)至156.03kda(同种型5)不等的多个同种型，其中典型序列(同种型1)大小为145.65kda(uniprot.org)。usp19的细胞定位可以是胞质或结合到内质网(lee j.等人,生物化学杂志(j.biol.chem.)(2014),289,3510-3507；lee j.等热,自然细胞生物学(nat.cell biol.)(2016),18,765-776)。usp19定位于内质网，其是内质网相关降解(erad)途径的关键组成部分(hassink b.等人,欧洲分子生物学组织会刊(embo j.)(2009),10,755-761；lee j.等人,生物化学杂志(j.biol.chem.)(2014),289,3510-3507；lee j.等人,自然细胞生物学(nat.cell biol.)(2016),18,765-776)。特别地，usp19参与蛋白质量控制机制的后期步骤，拯救已逆向移位至胞液的erad底物。还已证明usp19可以调节e3连接酶march6和hrd1的稳定性(nakamura n.等人,实验细胞研究(exp.cell res.)(2014),328,207-216；harada k.等人,国际分子科学杂志(int.j.mol.sci.)(2016),17,e1829)。此外，最近已表明usp19与多种潜在重要蛋白底物的稳定有关。例如，usp19与siah蛋白相互作用，以拯救hif1α在缺氧条件下免于降解(altun m.等人,生物化学杂志(j.biol.chem.)(2012),287,1962-1969；velasco k.等人,生物化学与生物物理进展(biochem.biophys.res.commun.)(2013),433,390-395)。usp19还稳定kpc1泛素连接酶，该酶参与p27kip1细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的调节(lu y.等人,分子细胞生物学(mol.cell biol.)(2009),29,547-558)。通过rnai敲除usp19导致p27kip1蓄积并抑制细胞增殖(lu l.等人,美国科学公共图书馆(plos one)(2011),6,e15936)。还发现usp19与细胞凋亡抑制剂(iap，包括c-iap1和c-iap2)相互作用(mei y.等人,生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011),286,35380-35387)。usp19敲低降低这些c-iap的总水平，而过表达增加birc2/ciap1和birc3/ciap2的水平。usp19敲低还以birc2/c-iap1和birc3/c-iap2依赖性方式增强tnfα诱导的胱天蛋白酶激活和细胞凋亡。除了一些直接参与调节缺氧反应和er应激外，最近还表明usp19通过去泛素化beclin-1作为自噬的正调节因子和i型干扰素信号传导(ifn，抗病毒免疫应答)的负调节因子。发现usp19通过去除beclin-1在赖氨酸437处的k11连接泛素链，在翻译后水平稳定beclin-1(jin s.等人,欧洲分子生物学组织会刊(embo j.)(2016),35,866-880)。usp19通过以beclin-1依赖性方式阻断rig-i-mavs相互作用，负调节i型ifn信号传导通路。usp19或beclin-1耗竭抑制自噬流并促进i型ifn信号传导以及细胞抗病毒免疫(jin s.等人,欧洲分子生物学组织会刊(embo j.)(2016),35,866-880；cui j.等人,自噬(autophagy)(2016),12,1210-1211)。最近的发现还表明，usp19可以通过调节traf3底物对细胞抗病毒i型ifn信号传导产生负作用(gu z.等人,未来微生物学(future microbiol.)(2017),12,767-779)。最近还表明usp19通过稳定辅助受体lrp6参与wnt信号传导通路(perrody e.等人,elife(2016),5,e19083)，并通过hdac1和hdac2蛋白参与调节dna修复过程，尤其是染色体稳定性和完整性(wu m.等人,肿瘤靶标(oncotarget)(2017),8,2197-2208)。

5、除了癌症和相关病况外，基因敲除研究还发现usp19与肌肉消耗综合征和其他骨骼肌肉萎缩病症有关(wing s.,国际生物化学与细胞生物学杂志(int.j.biochem.cellbiol.)(2013),45,2130-2135；wing s.等人,国际生物化学与细胞生物学杂志(int.j.biochem.cell biol.)(2016),79,426-468；wiles b.等人,分子生物细胞(mol.biol.cell)(2015),26,913-923；combaret l.等人,美国生理学内分泌代谢杂志(am.j.physiol.endocrinol.metab.)(2005),288,e693-700，其各自通过引用并入本文)。已知与病症(例如恶病质)相关的肌肉消耗损害生活质量和治疗反应，从而增加癌症患者的发病率和死亡率。肌肉消耗还与其他严重疾病有关，例如hiv/aids、心力衰竭、类风湿性关节炎和慢性阻塞性肺病(wiles b.等人,分子生物细胞(mol.biol.cell)(2015),26,913-923)。肌肉消耗还是衰老的突出特征。

6、除了上述病理病况之外，usp19还可能通过调节重要底物(例如α-突触核蛋白或含聚谷氨酰胺蛋白、ataxin3、亨廷顿蛋白)对退行性疾病(包括但不限于帕金森病和其他朊病毒样传播病症)的发病机制产生影响(he w.等人,美国科学公共图书馆(plos one)(2016),11,e0147515；bieri g.等人,疾病神经生物学(neurobiol dis.)(2018),109b,219-225)。通过usp19的活性调节coronin 2a(coro2a)已被证明影响视黄酸受体(rar)的转录抑制活性，表明usp19还可能参与rar介导的脂肪生成的调节(lim k.等人,肿瘤靶标(oncotarget)(2016),7,34759-34772)。

7、usp19与人病理学中涉及的众多蛋白之间已建立且不断增长的联系表明，usp19的小分子抑制剂可能具有有益于人健康的广泛治疗应用。然而，就目前所知，尚未报道靶向usp19的抑制剂，因此鉴定具有药物样潜力的此类抑制剂仍然是最重要和高度优先的。

技术实现思路

1、在第一方面，提供了式(i)的化合物：

2、

3、其中

4、r0是h、nh2、f或och3；

5、r1是任选取代的c1-c6烷基、乙基环丙基、乙基环丁基、任选取代的c5-c8芳基、任选取代的c3-c8杂芳基、任选取代的c3-c8杂环烷基、nrarb、nrach2rb、ora或och2ra

6、其中ra和rb独立地选自h、c1-c6烷基、cf3、任选取代的c3-c6环烷基、任选取代的c5-c8芳基、任选取代的c6-c9芳烷基和任选取代的c2-c8杂芳基，并且其中当r1是nrach2rb时，亚甲基基团可以任选地被cf3取代，

7、或r1是nrarb并且ra和rb与它们所附接的n一起形成任选取代的c2-c9杂环；

8、r2和r3独立地选自h和c1-c6烷基，或与它们所附接的碳一起形成c3-c6环烷基或c3-c6杂环烷基；

9、x不存在，是c、cr4a、cr4ar4b、n、nr4a或c＝o，

10、其中r4a和r4b独立地选自h、任选取代的c1-c6烷基和卤素；

11、或其中r4a和r4b一起形成包括它们所附接的碳的c3-c6环烷基或c3-c6杂环烷基；

12、y是c、cr5、cr5r6、n、nr5或o，

13、其中r5和r6独立地选自h、卤素、任选取代的c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、任选取代的c3-c6环烷基、任选取代的c3-c6杂环烷基、任选取代的c5-c8芳基、任选取代的c6-c9芳基烷基、任选取代的c3-c8杂芳基、ch2oh、nr’r”、ns(o)r’r”、so2r’、c(o)r’、cor’、c(o)or’、c(o)nr’r”、or’，其中r’和r”独立地选自h、c1-c6烷基、c5-c8芳基、c6-c9芳基烷基和c3-c8杂芳基，或其中r5是nr’r”并且r’和r”一起形成包括它们所附接的氮的任选取代的c3-6杂环烷基，

14、或其中r5和r6一起形成包括它们所附接的碳的c3-6环烷基或c3-c6杂环烷基；

15、z是n、nr7、c、cr7、cr7r8或c＝o，

16、其中r7和r8独立地选自h、卤素、氰基、氧代、任选取代的c1-c6烷基、c2-c6烯烃、c2-c6炔烃、c3-c6环烷基、任选取代的c3-c6杂环烷基、c5-c8芳基、c6-c9芳基烷基、c3-c8杂芳基、cn、c(o)orc、conrcrd、nrcrd、ns(o)rcrd、s(o)(rc)nrd、sorc、so2rc和src，其中rc和rd独立地是h、c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c5-c6芳基、c6-c9芳基烷基、c3-c6杂芳基、cn、cooh或coch3，或rc和rd与它们所附接的杂原子一起形成任选取代的c3-c7杂环；

17、或其中r7和r8一起形成包括它们所附接的碳的c3-6环烷基或c3-c6杂环烷基；

18、m不存在，是c、cr13或cr13r14，其中r13和r14独立地选自h和c1-c6烷基，或其中r13和r14与它们所附接的碳一起形成c3-c6环烷基或c3-c6杂环烷基；

19、和

20、a是cr9、chr9、n、nr9、s或o；

21、d是cr9、chr9、n或nr9，

22、g不存在，是cr9、chr9或n，

23、其中r9独立地选自h、卤素、c1-c6烷基、cf3和or*，其中r*选自任选取代的c1-c6烷基、任选取代的c3-c6环烷基和任选取代的c3-c6杂环烷基，

24、e是cr10、chr10、n、nr10、s或o，

25、其中r10选自h、卤素、c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c5-c8芳基、c6-c9芳基烷基、c4-c8杂芳基、srx、orx、nrxry和ns(o)rxry、s(o)(rx)nry

26、其中rx和ry独立地选自h、c1-c6烷基、cf3、c3-c6环烷基、c5-c8芳基、c6-c9芳烷基、c4-c8杂芳基、cooh、酰氨基、氰基、c2-c6烯烃、c2-c6炔烃，或其中rx和ry与它们所附接的氮一起形成任选取代的c4-c6杂环烷基；

27、或a、d、e和g均不存在，任选地其中x和m不存在，或任选地其中y和z一起形成任选取代的c5-c6芳基或c3-c6杂芳基稠合环，或z和m一起形成任选取代的c5-c6芳基或c5-c6杂芳基稠合环；

28、或具有选自以下结构的化合物：

29、

30、或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐。

31、第二方面提供了药物组合物，其包含根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

32、usp19与许多疾病和病况相关，包括(但不限于)癌症和肿瘤病况。通过rnai敲除usp19导致p27kip1蓄积并抑制细胞增殖(lu l.等人,美国科学公共图书馆(plos one)(2011),6,e15936)。还发现usp19与细胞凋亡抑制剂(iap，包括c-iap1和c-iap2)相互作用(mei y.等人,生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011),286,35380-35387)。usp19敲低降低这些c-iap的总水平，而过表达增加birc2/ciap1和birc3/ciap2的水平。usp19敲低还以birc2/c-iap1和birc3/c-iap2依赖性方式增强tnfα诱导的胱天蛋白酶激活和细胞凋亡。最近还表明usp19通过稳定辅助受体lrp6参与wnt信号传导通路(perrody e.等人,elife(2016),5,e19083)，并通过hdac1和hdac2蛋白参与调节dna修复过程，尤其是染色体稳定性和完整性(wu m.等人,肿瘤靶标(oncotarget)(2017),8,2197-2208)。

33、本文进一步证明，如第一方面所述的usp19抑制剂化合物在癌细胞系中表现出细胞渗透性和有效的靶标接合。癌细胞中的细胞渗透性和靶标接合与肌细胞中观察到的相当。如本文所证明的，usp19抑制剂对肌肉消耗表现出有效的体内治疗效果。因此，通过扩展，由于在癌细胞中观察到类似的靶标接合，因此由于usp19与上述致癌过程的关联，预期药理学usp19抑制剂将有效地在癌症中发挥治疗作用。

34、体内研究还表明，缺乏usp19基因的小鼠(usp19 ko小鼠)在喂食高脂肪饲料时表现出脂肪量减少(coyne e,等人,糖尿病学(diabetologia)(2019),62,136-146，其通过引用并入本文)。当喂食高脂肪饲料时，usp19ko小鼠还表现出更高的葡萄糖耐量和更高的胰岛素敏感性。

35、这些基因敲除研究描述了usp19与肥胖以及usp19与胰岛素敏感性之间的联系。然而，在本文提供的数据之前，尚未描述过体内研究证明usp19的药理学抑制剂是治疗肥胖的有效方法。类似地，在本文提供的数据之前，没有体内研究证明usp19的药理学抑制剂可以有效增加胰岛素敏感性。

36、usp19还涉及肌肉萎缩、肌肉消耗综合征和其他骨骼肌肉萎缩病症(wing s.,国际生物化学与细胞生物学杂志(int.j.biochem.cell biol.)(2013),45,2130-2135；wing s.等人,国际生物化学与细胞生物学杂志(int.j.biochem.cell biol.)(2016),79,426-468；wiles b.等人,分子生物细胞(mol.biol.cell)(2015),26,913-923；combaret l.等人,美国生理学内分泌代谢杂志(am.j.physiol.endocrinol.metab.)(2005),288,e693-700)。例如，研究证明usp19沉默诱导肌原纤维蛋白的表达并促进肌生成(sundaram p.等人,美国生理学内分泌代谢杂志(am.j.physiol.endocrinol.metab.)(2009),297,e1283-90；ogawam.等人,生物化学杂志(j.biol.chem.)(2011),286,41455-41465；ogawa m.等人,内分泌杂志(j.endocrinol.)(2015),225,135-145)。

37、敲除研究表明，缺乏usp19基因的小鼠对肌肉消耗有抵抗力，这是对糖皮质激素(肌肉萎缩的常见全身性病因)的反应，以及对去神经支配(失用性萎缩模型)的反应(bedard n.等人,美国实验生物学联合会会刊(faseb j.)(2015),29,3889-3898，其通过引用并入本文)。

38、如所附实施例中所阐述，本文证明了在野生型体内模型中用usp19抑制剂进行药理学处理可以诱导治疗效果。

39、特别地，证明了在体内模型中usp19抑制剂可以减少脂肪沉积，表明usp19抑制剂可以成为肥胖的有效治疗方法。

40、类似地，本文证明了在肌肉萎缩体内模型中usp19抑制剂可以减少肌肉质量的损失。

41、类似地，本文证明了usp19抑制剂可以治疗胰岛素抵抗的症状，如对葡萄糖的反应改善所表明。

42、根据本发明的化合物能够选择性抑制usp19活性。实施例进一步证明有效抑制usp19活性的化合物可以是有效的治疗性化合物。因此，本发明的化合物适用于治疗方法。适合用本发明化合物治疗的适应症包括：治疗和预防癌症和肿瘤病况；免疫和炎症病况，例如通过促进抗病毒免疫应答；治疗和预防肌肉萎缩，例如恶病质和少肌症；治疗和预防肥胖；治疗和预防胰岛素抵抗，例如糖尿病；治疗和预防神经退行性疾病，包括帕金森病和其他基于朊病毒的病症。

43、因此，在还一方面，提供了根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物，其用于治疗。

44、在还一方面，提供了根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物，其用于治疗或预防癌症的方法。在某些优选的实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌或神经母细胞瘤。

45、在还一方面，提供了根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物，其用于治疗或预防肌肉萎缩症、任选的恶病质或少肌症的方法。

46、在还一方面，提供了根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物，其用于治疗或预防肥胖的方法。

47、在还一方面，提供了根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物，其用于治疗或预防胰岛素抵抗的方法。

48、在还一方面，提供了根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物，其用于治疗或预防ii型糖尿病的方法。

49、在还一方面，提供了根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物，其用于治疗或预防帕金森病的方法。

50、在还一方面，提供了治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物。

51、在还一方面，提供了治疗肌肉萎缩的方法，其包括向受试者施用有效量的根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物。

52、在还一方面，提供了治疗帕金森病的方法，其包括向受试者施用有效量的根据第一方面的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐，或根据第二方面的药物组合物。

53、该化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、n-氧化物衍生物或药学上可接受的盐可以用作单药治疗或用作与放疗和/或另外的治疗剂的联合治疗。

54、本文提供的化合物的其他优选的实施方案出现在整个说明书中，特别是在实施例中。特别优选的是那些经测试具有更高活性的指定化合物。具有较高活性的化合物比具有较低活性的化合物更优选。

55、如本文所限定的每个方面或实施方案可以与任何其他方面或实施方案组合，除非明确相反地指示。具体地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。