灌注培养哺乳动物细胞的方法与流程

本发明涉及重组蛋白的生物技术和制造的方法。

背景技术：

1、含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞通常用于生产在治疗上或商业上重要的蛋白质。在当前产品线多样化的环境中，生物技术公司越来越多地致力于开发创新的解决方案来高度灵活且成本有效地制造治疗性蛋白质药物物质。

技术实现思路

1、本发明至少部分基于以下发现：灌注培养哺乳动物细胞的方法包括：提供含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的器皿，所述第一液体培养基具有约270mosm/kg至约380mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度；将所述哺乳动物细胞在约32℃至约39℃下孵育一定时间段；以及在所述时间段内，连续或周期性地去除第一体积的所述第一液体培养基，并且向所述第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一体积和第二体积大致相等，并且所述器皿中的第一液体培养基的重量渗透压摩尔浓度和第二液体培养基的重量渗透压摩尔浓度在所述时间段内维持在约270mosm/kg至约380mosm/kg，与在所述时间段内重量渗透压摩尔浓度不维持在约270mosm/kg至约380mosm/kg的情况下的其他灌注细胞培养方法相比，实现了培养物生长和健康的改善。

2、本文提供了灌注培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：提供含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的器皿，所述第一液体培养基具有约270mosm/kg至约380mosm/kg(例如，其中的任何子范围)的重量渗透压摩尔浓度；将所述哺乳动物细胞在约32℃至约39℃(例如，其中的任何子范围)下孵育一定时间段；以及在所述时间段内，连续或周期性地去除第一体积的所述第一液体培养基，并且向所述第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一体积和第二体积大致相等，并且所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的重量渗透压摩尔浓度在所述时间段内维持在约270mosm/kg至约380mosm/kg(例如，其中的任何子范围)。

3、在一些实施方案中，第一液体培养基具有约270mosm/kg至约320mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在一些实施方案中，第二液体培养基包含大于8g/l的泊洛沙姆。在一些实施方案中，第二液体培养基包含大于10g/l的泊洛沙姆。在一些实施方案中，第二液体培养基包含大于12g/l的泊洛沙姆。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述泊洛沙姆是pluronic f68。在本文所述任何方法的一些实施方案中，第二液体培养基具有约6.8至约7.1的ph。在本文所述任何方法的一些实施方案中，第二液体培养基包含氯化钠。在本文所述任何方法的一些实施方案中，第二液体培养基具有约800mosm/kg至约2,500mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，第二液体培养基具有约1,200mosm/kg至约1,800mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内增加所添加的第二液体培养基的第二体积。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内基于活细胞密度增加所添加的第二液体培养基的第二体积。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的重量渗透压摩尔浓度的维持包括在所述时间段内的某个时间点调节所述第二液体培养基的流速。

4、在一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点增加所述第二液体培养基的流速。

5、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法包括在所述时间段内的某个时间点调节所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的ph和pco2中之一或两者。

6、在一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点降低所述第二液体培养基的流速。

7、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内增加所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的pco2并且增加ph。

8、在一些实施方案中，在所述时间段内基于活细胞密度增加所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的pco2和ph。

9、在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基和第二液体培养基中大于60x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基和第二液体培养基中大于100x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基和第二液体培养基中大于120x 106个细胞/ml的活细胞密度。

10、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内监测所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的重量渗透压摩尔浓度。

11、在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除和所述第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除和所述第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除和所述第二体积的第二液体培养基的添加是周期性地进行的。

12、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内将第三体积的水溶液周期性地添加到所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基中，其中所述第一体积大致等于所述第二体积和所述第三体积的总和，并且所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度在所述时间段内维持在约270mosm/kg至约380mosm/kg。

13、在一些实施方案中，所述水溶液是盐溶液。在一些实施方案中，所述盐溶液是氯化钠溶液或氯化钾溶液。

14、在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是同时进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是连续进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是周期性地进行的。

15、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述第一液体培养基中连续或周期性地添加第三体积的第三液体培养基，其中所述第一体积大致等于所述第二体积和所述第三体积的总和，并且所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度在所述时间段内维持在约270mosm/mg至约380mosm/kg。

16、在一些实施方案中，所述第三液体培养基具有约270mosm/kg至约380mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度的维持包括在所述时间段内调节所述第二液体培养基的流速。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点增加所述第二液体培养基的流速。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点降低所述第二液体培养基的流速。

17、在一些实施方案中，所述第三液体培养基具有约10mosm/kg至约270mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在一些实施方案中，所述第三液体培养基具有约50mosm/kg至约200mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。

18、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度的维持包括在所述时间段内调节所述第三液体培养基的流速。

19、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点增加所述第三液体培养基的流速。

20、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点降低所述第三液体培养基的流速。

21、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内的某个时间点调节所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的ph和pco2中之一或两者。在一些实施方案中，所述方法包括在所述时间段内增加所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的pco2并且增加ph。在一些实施方案中，在所述时间段内基于活细胞密度增加所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的pco2和ph。

22、在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和所述第三液体培养基中大于60x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和所述第三液体培养基中大于100x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和所述第三液体培养基中大于120x106个细胞/ml的活细胞密度。

23、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内监测所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是同时进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是连续进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是周期性地进行的。

24、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是cho细胞。

25、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿是生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器是灌注生物反应器。

26、本文还提供了生产重组蛋白的方法，所述方法包括：提供含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的器皿，所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸，所述第一液体培养基具有约270mosm/kg至约380mosm/kg(例如，其中的任何子范围)的重量渗透压摩尔浓度；将所述哺乳动物细胞在约32℃至约39℃(例如，其中的任何子范围)下孵育一定时间段；以及在所述时间段内，连续或周期性地去除第一体积的所述第一液体培养基，并且向所述第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一体积和第二体积大致相等，并且所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的重量渗透压摩尔浓度在所述时间段内维持在约270mosm/kg(例如，其中的任何子范围)至约380mosm/kg；以及从所述哺乳动物细胞或从所述第一液体培养基和/或第二液体培养基中回收所述重组蛋白。

27、在一些实施方案中，第一液体培养基具有约270mosm/kg至约320mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在一些实施方案中，第二液体培养基包含大于8g/l的泊洛沙姆。在一些实施方案中，第二液体培养基包含大于10g/l的泊洛沙姆。在一些实施方案中，第二液体培养基包含大于12g/l的泊洛沙姆。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述泊洛沙姆是pluronic f68。在本文所述任何方法的一些实施方案中，第二液体培养基具有约6.8至约7.1的ph。在本文所述任何方法的一些实施方案中，第二液体培养基包含氯化钠。

28、在本文所述任何方法的一些实施方案中，第二液体培养基具有约800mosm/kg至约2,500mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在一些实施方案中，所述第二液体培养基具有约1,200mosm/kg至约1,800mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内增加所添加的第二液体培养基的第二体积。在一些实施方案中，在所述时间段内基于活细胞密度增加所添加的第二液体培养基的第二体积。

29、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的重量渗透压摩尔浓度的维持包括在所述时间段内的某个时间点调节所述第二液体培养基的流速。在一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点增加所述第二液体培养基的流速。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内的某个时间点调节所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的ph和pco2中之一或两者。在一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点降低所述第二液体培养基的流速。

30、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内增加所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的pco2并且增加ph。在一些实施方案中，在所述时间段内基于活细胞密度增加所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的pco2和ph。

31、在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基和第二液体培养基中大于60x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基和第二液体培养基中大于100x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基和第二液体培养基中大于120x 106个细胞/ml的活细胞密度。

32、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内监测所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除和所述第二体积的第二液体培养基的添加是同时进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除和所述第二体积的第二液体培养基的添加是连续进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除和所述第二体积的第二液体培养基的添加是周期性地进行的。

33、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述重组蛋白被分泌到所述第一液体培养基和/或第二液体培养基中。在一些实施方案中，从所述第一液体培养基和/或第二液体培养基中回收所述重组蛋白。

34、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内将第三体积的水溶液连续或周期性地添加到所述器皿中的第一液体培养基和第二液体培养基中，其中所述第一体积大致等于所述第二体积和所述第三体积的总和，并且所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度在所述时间段内维持在约270mosm/kg至约380mosm/kg。在一些实施方案中，所述水溶液是盐溶液。在一些实施方案中，所述盐溶液是氯化钠溶液或氯化钾溶液。

35、在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是同时进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是连续进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是周期性地进行的。

36、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述第一液体培养基中连续或周期性地添加第三体积的第三液体培养基，其中所述第一体积大致等于所述第二体积和所述第三体积的总和，并且所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度在所述时间段内维持在约270mosm/kg至约380mosm/kg。

37、在一些实施方案中，所述第三液体培养基具有约270mosm/kg至约380mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度的维持包括在所述时间段内调节所述第二液体培养基的流速。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点增加所述第二液体培养基的流速。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点降低所述第二液体培养基的流速。在一些实施方案中，所述第三液体培养基具有约0mosm/kg至约270mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在一些实施方案中，所述第三液体培养基具有约50mosm/kg至约200mosm/kg的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度的维持包括在所述时间段内调节所述第三液体培养基的流速。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点增加所述第三液体培养基的流速。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括在所述时间段内的某个时间点降低所述第三液体培养基的流速。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内的某个时间点调节所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的ph和pco2中之一或两者。

38、在一些实施方案中，所述方法包括在所述时间段内增加所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的pco2并且增加ph。在一些实施方案中，在所述时间段内基于活细胞密度增加所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的pco2和ph。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和所述第三液体培养基中大于60x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和所述第三液体培养基中大于100x 106个细胞/ml的活细胞密度。在一些实施方案中，在所述时间段内实现所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和所述第三液体培养基中大于120x 106个细胞/ml的活细胞密度。

39、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述时间段内监测所述器皿中的第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基的重量渗透压摩尔浓度。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是同时进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是连续进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，在所述时间段内所述第一体积的第一液体培养基的去除、所述第二体积的第二液体培养基的添加和所述第三体积的添加是周期性地进行的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述重组蛋白被分泌到所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和/或所述第三液体培养基中。在一些实施方案中，从所述第一液体培养基、所述第二液体培养基和/或所述第三液体培养基中回收所述重组蛋白。

40、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是cho细胞。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述器皿是生物反应器。在一些实施方案中，所述生物反应器是灌注生物反应器。在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段、或工程化蛋白。在本文所述任何方法的一些实施方案中，从所述哺乳动物细胞中回收所述重组蛋白。

41、在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括分离所述重组蛋白。在一些实施方案中，所述方法进一步包括配制所分离的重组蛋白。

42、本文提供了通过本文所述任何方法产生的重组蛋白。本文还提供了包含本文所述任何重组蛋白的药物组合物以及包含本文所述任何药物组合物的试剂盒。

43、本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述任何药物组合物。

44、如本文所用，名词前的词语“一个/种”表示一个/种或多个/种所述特定名词。例如，短语“一个哺乳动物细胞”表示“一个或多个哺乳动物细胞”。

45、术语“哺乳动物细胞”意指来自或源自任何哺乳动物(例如，人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、奶牛或兔)的任何细胞。例如，哺乳动物细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是分化细胞或未分化细胞。本文描述了哺乳动物细胞的非限制性例子。哺乳动物细胞的另外例子是本领域已知的。

46、术语“培养”或“细胞培养”意指哺乳动物细胞在受控的一组物理条件下维持或增殖。

47、术语“哺乳动物细胞的培养物”、“培养物”或“细胞培养物”意指含有在一组受控的物理条件下维持或增殖的多个哺乳动物细胞的液体培养基。

48、术语“液体培养基(liquid culture medium)”或“液体培养基(liquid medium)”意指含有足够营养物以允许细胞(例如，哺乳动物细胞)在体外生长或增殖的流体。例如，液体培养基可以含有以下中的一种或多种：氨基酸(例如，20种氨基酸)、嘌呤(例如，次黄嘌呤)、嘧啶(例如，胸苷)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸，生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺、丙酮酸盐、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、铁、铜、锌和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可以含有来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基不含来自哺乳动物的血清或其他提取物(成分明确的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可以含有痕量金属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的另一个例子是基本培养基(例如，仅含有无机盐、碳源和水的培养基)。本文描述了液体培养基的非限制性例子。液体培养基的另外例子是本领域已知的并且是可商购的。液体培养基可以含有任何密度的哺乳动物细胞。例如，如本文所用，从生物反应器中去除的一定体积的液体培养基可以基本上不含哺乳动物细胞。

49、术语“无动物源性组分的液体培养基”意指不含任何源自哺乳动物的组分(例如，蛋白质或血清)的液体培养基。

50、术语“无血清液体培养基”意指不含哺乳动物血清的液体培养基。

51、术语“含血清的液体培养基”意指含有哺乳动物血清的液体培养基。

52、术语“化学成分明确的液体培养基”是本领域的术语并且意指其中所有化学组分都已知的液体培养基。例如，化学成分明确的液体培养基不含胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，因为这些制剂典型地含有白蛋白与脂质的复杂混合物。

53、术语“无蛋白质液体培养基”意指不含任何蛋白质(例如，任何可检测的蛋白质)的液体培养基。

54、术语“澄清的液体培养基”意指从细菌或酵母细胞培养物获得的基本上不含(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％不含)细菌或酵母细胞的液体培养基。

55、术语“搅动”意指在生物反应器中搅拌或以其他方式移动液体培养基的一部分。这是为了例如增加生物反应器中液体培养基中溶解的o2浓度而进行的。可以使用任何本领域已知的方法(例如，仪器或螺旋桨)进行搅动。可以用于对生物反应器中的液体培养基的一部分执行搅动的示例性设备和方法是本领域已知的。

56、术语“免疫球蛋白”意指含有至少15个氨基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的氨基酸序列(例如，可变结构域序列、框架序列或恒定结构域序列)的免疫球蛋白蛋白质的多肽。免疫球蛋白可以例如包括至少15个氨基酸的轻链免疫球蛋白，例如至少15个氨基酸的重链免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是分离抗体(例如，igg、ige、igd、iga或igm)。免疫球蛋白可以是抗体片段，例如fab片段、f(ab')2片段或scfv片段。免疫球蛋白还可以是双特异性抗体或三特异性抗体；或二聚体、三聚体、多聚体抗体；或双抗体、或免疫球蛋白还可以是含有至少一个免疫球蛋白结构域的工程化蛋白(例如，融合蛋白)。本文描述了免疫球蛋白的非限制性例子，并且免疫球蛋白的另外例子是本领域已知的。可以使用本文所述任何方法来生产重组免疫球蛋白。

57、术语“工程化蛋白”意指不是由生物体(例如，哺乳动物)内存在的内源性核酸天然编码的多肽。工程化蛋白的例子包括酶(例如，具有使工程化酶的稳定性和/或催化活性增加的一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加)、融合蛋白、抗体(例如，二价抗体、三价抗体或双抗体)和含有至少一个重组支架序列的抗原结合蛋白。

58、术语“分泌型蛋白”或“分泌型重组蛋白”意指这样的蛋白质(例如，重组蛋白)，其在哺乳动物细胞内转译时最初含有至少一个分泌信号序列，并且在哺乳动物细胞中至少部分通过酶促切割分泌信号序列而至少部分分泌到细胞外空间(例如，液体培养基)中。技术人员应理解“分泌型”蛋白不需要完全从细胞中解离以被认为是分泌型蛋白。

59、术语“灌注生物反应器”意指在第一液体培养基中含有多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的生物反应器，其中存在于所述生物反应器中的细胞的培养包括定期或连续去除第一液体培养基并且同时或此后不久将基本上相同体积的第二液体培养基添加至所述生物反应器。在一些例子中，在培养时间段内经递增的时间段(例如，约24小时的时间段、在约1分钟与约24小时之间的时间段或大于24小时的时间段)去除和添加的第一液体培养基的体积存在递增变化(例如，增加或减少)(例如，液体培养基的每天再进料速率)。每天去除和更换的培养基的分数可以根据培养的特定细胞、初始接种密度和特定时间的细胞密度而变化。“rv”或“反应器体积”意指在培养过程开始时存在的液体培养基的体积(例如，接种后存在的液体培养基的总体积)。

60、“比生产率”或“sp”是本领域的术语，并且如本文所用，是指每个哺乳动物细胞每天产生的重组治疗性蛋白质的质量或酶活性。重组治疗性抗体的sp通常以质量/细胞/天来测量。重组治疗性酶的sp通常以单位/细胞/天或(单位/质量)/细胞/天来测量。

61、“体积生产率”或“vp”是本领域的术语，并且如本文所用，是指每体积培养物(例如，每l生物反应器、器皿、或管体积)每天产生的重组治疗性蛋白质的质量或酶活性。重组治疗性抗体的vp通常以质量/l/天来测量。重组治疗性酶的vp通常以单位/l/天或质量/l/天来测量。

62、短语“浓度的泊洛沙姆”和“泊洛沙姆浓度”在本文中可互换使用。短语“x g/l或更多的泊洛沙姆”和“x g/l或更大浓度x g/l的泊洛沙姆”在本文中可互换使用。

63、除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域所属领域普通技术人员的一般理解相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和例子仅是说明性的而非旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据条目和其他参考文献均通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，将以包括定义的本说明书为准。

64、从以下具体实施方式和附图以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得清楚。