抗紧密连接蛋白-6的抗体及其用途的制作方法

本公开属于免疫治疗领域，涉及与人紧密连接蛋白-6(claudin-6)(cldn6)结合的抗体及其片段、编码这些抗体的多核苷酸序列以及产生其的细胞。本公开还涉及包含这些抗体的治疗组合物，以及使用其用于癌症检测、预后以及基于抗体的免疫治疗的方法。

背景技术：

1、紧密连接蛋白(cldn)家族由27个成员组成，以细胞和组织类型选择性的方式显示出不同的表达模式。紧密连接蛋白是位于上皮细胞和内皮细胞的紧密连接(tightjunction，tj)内的整合膜蛋白。cldn彼此之间在同一细胞(顺式相互作用)和相邻细胞(反式相互作用)中相互作用，从而形成具有组织特异性屏障功能的tj。各个细胞类型表达多于一种紧密连接蛋白家族成员。在正常生理学中，紧密连接蛋白与多种蛋白质相互作用，密切参与来自紧密连接以及去向紧密连接的信号转导(lal-nag,m和morin,p.j.，genome biol10:235,2009)。

2、cldn蛋白包含四个跨膜(tm)螺旋(tm1、tm2、tm3和tm4)和两个细胞外环(eli和el2)。来自相邻细胞的紧密连接蛋白的细胞外环彼此相互作用，以密封细胞片层并调节腔(luminal)和基底外侧空间之间的细胞旁路运输。紧密连接蛋白结构在不同家族成员中高度保守，cldn6包含220个氨基酸，大小为23kda，表现出紧密连接蛋白典型的蛋白质结构。

3、与大多数广泛表达的紧密连接蛋白不同，cldn6的特征是选择性表达(hewitt等人，bmc cancer,6:186,2006)。cldn6是一种在多种类型的胚胎上皮细胞中表达的癌胚胎的(oncofetal)紧密连接分子。紧密连接的紊乱和紧密连接分子的失调是癌细胞的常见标志，经常与恶性转化相关。cldn6表达在多种癌症类型中异常激活，包括胃癌、肺癌和卵巢腺癌、子宫内膜癌和胚胎癌、儿童脑肿瘤(例如，非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤)和生殖细胞肿瘤(hassimoto等人，j pharmacol exp ther368:179-186,2019；kojima等人，cancers 2020,12,2748)。因此，cldn6已被鉴定为肿瘤相关抗原。作为一种肿瘤相关抗原，由于cldn6在表皮形态发生的早期阶段表达，在这里cldn6对于表皮分化和屏障形成至关重要，因此cldn6可以被归类为分化抗原。cldn6在癌症中而非成人正常组织中的独特表达模式，加上其在细胞表面对抗体的可及性，使cldn6成为多种癌症类型诊断和免疫治疗方法的有前景靶标。

4、在cldn6与其他紧密连接蛋白之间存在高度的序列保守性。cldn6与其他紧密连接蛋白(例如，cldn9、cldn4和cldn3)的高度同源性使得难以提供具有适合治疗用途特性(如特异性、亲和性和安全性)的cldn6抗体。

5、靶向紧密连接蛋白-6的基于抗体的免疫治疗抗体可以调节cldn6的活性和/或指导针对表达cldn6的癌症的细胞毒性反应。因此，需要抗cldn6的抗体。

技术实现思路

1、本公开通过提供能够结合癌细胞上存在的紧密连接蛋白-6的抗cldn6抗体和片段来解决上述需求。这些抗体及其片段的特征在于独特的cdr序列组、对cldn6的特异性、以及用于癌症检测、预后和免疫治疗。更具体地，本公开涉及结合人cldn6的抗体，以及其用于检测表达cldn-6的肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的存在、调节定位于肿瘤微环境的细胞的cldn6介导的活性或指导针对表达cldn6的癌症的细胞毒性反应的用途。

2、根据一些实施方案，抗体或抗体片段包含一组六个互补决定区(cdr)序列，其选自重链(hc)可变区的三个cdr(选自seq id no:1、3、23、24、26、28和30)和轻链(lc)可变区的三个轻链cdr(选自seq id no:2、4、25、27、29和31)，或与所鉴定的抗体或片段序列具有至少90％序列同一性的其类似物或衍生物。

3、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有cdr1:seqid no:5、cdr2：seq id no:6和cdr3：seq id no:7；和/或轻链可变区，其含有cdr1:seq idno:8、cdr2：seq id no:9和cdr3：seq id no:10。

4、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有cdr1:seqid no:11、cdr2：seq id no:12和cdr3：seq id no:13；和/或轻链可变区，其含有cdr1:seqid no:14、cdr2：seq id no:15和cdr3：seq id no:16。

5、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有cdr1:seqid no:32、cdr2：seq id no:33和cdr3：seq id no:34；和/或轻链可变区，其含有cdr1:seqid no:35、cdr2：seq id no:36和cdr3：seq id no:37。

6、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有cdr1:seqid no:38、cdr2：seq id no:39和cdr3：seq id no:40；和/或轻链可变区，其含有cdr1:seqid no:41、cdr2：seq id no:42和cdr3：seq id no:43。

7、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有cdr1:seqid no:38、cdr2：seq id no:44和cdr3：seq id no:40；和/或轻链可变区，其含有cdr1:seqid no:41、cdr2：seq id no:45和cdr3：seq id no:43。

8、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有cdr1:seqid no:46、cdr2：seq id no:47和cdr3：seq id no:48；和/或轻链可变区，其含有cdr1:seqid no:49、cdr2：seq id no:50和cdr3：seq id no:51。

9、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含选自seq id no:1、3、23、24、26、28和30的可变重链序列。

10、在其他实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含选自seq id no:2、4、25、27、29和31的可变轻链序列。

11、在其他实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段包含选自seq id no:1、3、23、24、26、28和30的可变重链序列和选自seq id no:2、4、25、27、29和31的可变轻链序列。

12、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或抗体片段包含可变重链和可变轻链序列，其选自以下组合：

13、(a)包含seq id no:1的可变重链序列和包含seq id no:2的可变轻链序列；

14、(b)包含seq id no:3的可变重链序列和包含seq id no:4的可变轻链序列；

15、(c)包含seq id no:23的可变重链序列和包含seq id no:2的可变轻链序列；

16、(d)包含seq id no:24的可变重链序列和包含seq id no:25的可变轻链序列；

17、(e)包含seq id no:26的可变重链序列和包含seq id no:27的可变轻链序列；

18、(f)包含seq id no:28的可变重链序列和包含seq id no:29的可变轻链序列；和

19、(g)包含seq id no:30的可变重链序列和包含seq id no:31的可变轻链序列。

20、在一些实施方案中，提供一种免疫偶联物，其包含共价连接至细胞毒性剂的与cldn6结合的抗体，其中所述抗体包含选自以下组合的可变重链和可变轻链序列：

21、(a)包含seq id no:1的可变重链序列和包含seq id no:2的可变轻链序列；和

22、(b)包含seq id no:3的可变重链序列和包含seq id no:4的可变轻链序列；

23、(c)包含seq id no:23的可变重链序列和包含seq id no:2的可变轻链序列；

24、(d)包含seq id no:24的可变重链序列和包含seq id no:25的可变轻链序列；

25、(e)包含seq id no:26的可变重链序列和包含seq id no:27的可变轻链序列；

26、(f)包含seq id no:28的可变重链序列和包含seq id no:29的可变轻链序列；和

27、(g)包含seq id no:30的可变重链序列和包含seq id no:31的可变轻链序列。

28、在一些实施方案中，提供一种免疫偶联物，其包含共价连接至细胞毒性剂的与紧密连接蛋白-6结合的抗体，其中所述抗体包含(a)包含cdrl：seq id no:5、cdr2：seq idno:6和cdr3：seq id no:7的重链可变区；和/或包含cdr1:seq id no:8、cdr2：seq id no:9和cdr3：seq id no:10的轻链可变区；(b)包含cdrl：seq id no:11、cdr2：seq id no:12和cdr3：seq id no:13的重链可变区；和/或包含cdr1:seq id no:14、cdr2：seq id no:15和cdr3：seq id no:16的轻链可变区；(c)包含cdrl：seq id no:32、cdr2：seq id no:33和cdr3：seq id no:34的重链可变区；和/或包含cdr1:seq id no:35、cdr2：seq id no:36和cdr3：seq id no:37的轻链可变区；(d)包含cdrl：seq id no:38、cdr2：seq id no:39和cdr3：seq id no:40的重链可变区；和/或包含cdr1:seq id no:41、cdr2：seq id no:42和cdr3：seq id no:43的轻链可变区；(e)包含cdrl：seq id no:38、cdr2：seq id no:44和cdr3：seq id no:40的重链可变区；和/或包含cdr1:seq id no:41、cdr2：seq id no:45和cdr3：seq id no:43的轻链可变区；和(f)包含cdr1：seq id no:46、cdr2：seq id no:47和cdr3：seq id no:48的重链可变区；和/或包含cdr1:seq id no:49、cdr2：seq id no:50和cdr3：seq id no:51的轻链可变区。

29、在一些实施方案中，抗cldn6抗体及其抗体片段包含表1中公开的一种或多种重链可变区cdr和/或表2中公开的一种或多种轻链可变区cdr。

30、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或其抗体片段单独或组合地表现出一种或多种以下结构和功能特征：(a)与在其细胞表面表达人cldn6的细胞相结合；(b)选择性结合紧密连接蛋白-6cho-k1细胞，其信号(例如，mfi)是同种型对照抗体对在紧密连接蛋白-6-cho-k1细胞上表达的cldn6的结合活性的约20至25倍，或是同种型对照抗体对紧密连接蛋白-6-hek293细胞上表达的cldn6的结合活性的20至30倍，以及选择性结合紧密连接蛋白-9hek293细胞，其信号仅为同种型对照抗体的结合活性的16倍；(c)与表达紧密连接蛋白-6的细胞(紧密连接蛋白-6cho-k1细胞)和紧密连接蛋白-9的细胞(hek293细胞)同等地结合，其信号是同种型对照抗体的结合活性的约25至60倍；(d)与表达cldn3、cldn4的细胞微弱结合或根本不结合；(e)结合内源表达紧密连接蛋白-6的nec8细胞，但不结合已经敲除了紧密连接蛋白6基因的nec8细胞；(f)任选地与鼠cldn6交叉反应；(g)在结合后，从紧密连接蛋白-6阳性的细胞表面有效地内化，在内源表达紧密连接蛋白-6的nec8细胞中诱导内吞作用介导的细胞毒性；和(h)针对在其天然构象中携带cldn6的细胞表现出一种或多种免疫效应功能，其中所述一种或多种免疫效应功能选自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、t细胞依赖性细胞毒性(tdcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。

31、在一些实施方案中，抗cldn6抗体特异性地结合表达内源水平的紧密连接蛋白-6的人细胞和经工程化以过表达紧密连接蛋白-6的宿主细胞，而不表现出对紧密连接蛋白-3或紧密连接蛋白-4的结合。在一个实施方案中，抗cldn6抗体结合在人睾丸胚胎癌(nec8细胞)上内源表达的cldn6。在一些实施方案中，抗cldn6抗体结合在人卵巢癌(ov90细胞)上内源表达的cldn6。在一些实施方案中，cldn6特异性抗体或抗体片段以低于100nm的亲和力与人紧密连接蛋白-6结合。在其他实施方案中，cldn6/9特异性抗体或抗体片段选择性结合人cldn6和人cldn9。

32、在一些实施方案中，抗体能够结合与表达cldn6的细胞表面相连(associate)的cldn6。优选地，表达cldn6的细胞是完整的细胞，特别是非透化的细胞，由抗体结合的cldn6蛋白与具有天然(例如，非变性)构象的细胞表面相连。在一个具体实施方案中，抗体基本上不能：结合与表达cldn9的细胞表面相连的cldn9；或结合与表达cldn4的细胞表面相连的cldn4和/或结合与表达cldn3的细胞表面相连的cldn3。

33、在一个实施方案中，抗cldn6抗体或抗体片段相对于cldn9选择性结合cldn6，不结合紧密连接蛋白-3(cldn3)、紧密连接蛋白-4(cldn4)。在另一个实施方案中，抗cldn6抗体或抗体片段同等地结合cldn6和cldn 9两者(例如，对两个cldn中的任一没有偏好)。在一些实施方案中，使用经工程化以过表达cldn6的宿主细胞(例如，293t-cldn6或cho-cldn6)中的任一，在基于facs的测定法中，抗体表现出的ec50小于约50nm(例如，小于约75nm、小于约50nm、小于约25nm、小于约10nm)。

34、在一些实施方案中，抗体或其片段表现出针对在其天然构象中携带cldn6的细胞的一种或多种免疫效应功能，其中一种或多种免疫效应功能优选选自抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)、细胞凋亡的诱导和增殖的抑制，优选地，效应功能是adcc和/或cdc。

35、在一些实施方案中，抗体或其片段可以连接一种或多种治疗效应物部分(例如，放射性标记、细胞毒素、治疗酶、诱导细胞凋亡的试剂等)以提供靶向的细胞毒性，例如，杀死肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗cldn6抗体特异性结合出现在肿瘤细胞表面的人cldn6，有效地诱导cldn6的内化或指导细胞介导的对肿瘤细胞的杀死。

36、在一些实施方案中，抗cldn6抗体掺入至免疫偶联物中，所述免疫偶联物包含与一种或多种细胞毒性剂偶联的抗cldn6抗体，所述细胞毒性剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素，酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性偶联物)。

37、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或抗体片段可以包含恒定区(即fc区)的取代或修饰，包括但不限于氨基酸残基取代、突变和/或修饰，这产生的化合物具有一种或更多种增强的adcc、cdc、adcp、tdcc抗体介导的效应功能。

38、在一些实施方案中，抗cldn6抗体或抗体片段包含源自本文公开的单个抗cldn6抗体的vh或vl结构域的六(6)个cdr或其变体。例如，结合剂可以包含抗cldn6抗体(称为“nr.n6.ab1”)的全部六个cdr区。在代表性示例中，抗体或其抗体片段可以包含seq id no:5-7和seq id no:8-10的氨基酸序列，其代表抗人cldn6抗体(本文称为“nr.n6.ab1”)的可变重链区的cdr1、cdr2和cdr3以及可变轻链区的cdr1、cdr2和cdr3。

39、本文公开的任何抗cldn6抗体可以是完全人的、嵌合的、cdr移植的、人源化的或重组的抗体，或其片段。在一个可替选的实施方案中，公开的抗cldn6抗体或抗体片段可以开发用于以各种替代形式使用，包括双特异性或多特异性形式。

40、在一些实施方案中，cldn6抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在进一步的实施方案中，抗体片段选自：fab、fab'、f(ab’)2、fd、fv、scfv和scfv-fc片段、单链抗体、微型抗体和双抗体。

41、本公开还提供了编码本文公开的任何抗cldn6抗体的核酸。在相关实施方案中，本公开提供了包含一种或多种编码本文公开的抗cldn6抗体的核酸的载体、或包含所述载体的宿主细胞。

42、cldn6抗体及其抗体片段可以用于治疗癌症。表达cldn6的癌细胞是靶向cldn6的治疗(如使用针对cldn6的抗体进行的治疗)的合适靶标。这种用于治疗或癌症的方法可以包括向需要其的受试者施用包含cldn6抗体或其抗体片段的组合物或制剂。

43、例如，cldn6抗体或其抗体片段可以单独施用(例如，作为单一疗法)、或与其他免疫治疗剂和/或化学疗法组合施用。在一个实施方案中，cldn6抗体或片段用于制备适合介导杀死表达cldn6的癌细胞的adc。在一个可替选的实施方案中，cldn6抗体用于工程化重组抗体，其被设计为通过增强的adcc、adcp、tdcc或cdd杀死肿瘤细胞。

44、本公开还提供了治疗癌症的方法，包括向需要其的受试者施用包含adc的药物组合物，其中adc包含偶联至有效载荷的本文公开的抗cldn6抗体或抗体片段。在一些实施方案中，该方法包括向需要其的受试者施用包含抗cldn adc的药物组合物，其中癌症选自子宫癌、睾丸癌、卵巢癌和肺癌。