Cas12f1突变体及其应用

本发明属于生物，具体为cas12f1a蛋白及其用途。

背景技术：

1、crispr-cas系统是由成簇规则间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(crispr-associated protein，cas)组成，存在于大部分的古细菌和细菌中。crispr-cas作为古细菌和绝大多数细菌的获得性免疫系统，发挥抵御外源核酸、质粒和病毒入侵的功能。按照cas蛋白的组成可以将crispr-cas系统可分为两类：第1类系统依赖的cas蛋白为多亚基蛋白复合物，第2类系统依赖的cas蛋白为单一效应蛋白。最为常用的crispr-cas9，crispr-cas12和crispr-cas13系统均属于第二类系统。对crispr-cas系统的免疫机制进行研究和改造后，实现了将其应用于特异性分子靶标检测，发展出了基于crispr-cas系统的分子检测技术。基于cas12和cas13的核酸检测方法依赖于cas蛋白的反式切割活性，当cas蛋白与grna(guide rna，向导rna)、靶核酸序列形成效应复合物时，其附属切割活性被激活，对已被标记的dna或rna探针序列进行切割，从而释放出信号达到检测效果。

2、cas12f1(又称cas14a1)是迄今为止记录的最小的第2类crispr-cas效应子，长度在400到700个氨基酸之间。与其他常用cas蛋白(cas9,cas13a，cas12a和cas12b)不同，cas12f1的功能发挥需要二聚化过程。两个拷贝的cas12f1与一个crrna和一个tracrrna 结合，从而识别靶向dna底物。crrna与tracrrna可人工改造融合成一个单向导rna(single-guide rna，sgrna)。cas12f1的二聚化可能是为了弥补cas12f1蛋白的有限大小，从而能够识别约20碱基对的靶标dna序列。最初发现cas12f1特异性靶向ssdna(single-strand dna，单链dna)。不过，最近的报道表明，cas12f1也能识别含有5't-rich pam的dsdna(double-strand dna，双链dna)。与其他cas12a和cas12b类似，cas12f1与互补靶dna结合后，也能激发其非特异性的反式裂解ssdna活性。

3、crispr-cas12和crispr-cas13是最常用的基于crispr原理的分子检测系统，如何快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向，尤其是如何对核酸进行多重检测，是急待解决的问题。现有的研究认为，crispr-cas12f1系统特异性地靶向dna并激活其反式dnase活性，且不具有rnase活性，从而只切割标记的ssdna探针序列。crispr-cas13a系统特异性地靶向rna并激活其反式rnase活性，且不具有dnase活性，从而只切割标记的rna探针序列。如结合使用这两个系统，就可实现单管同时检测两种靶标而不互相干扰。但是我们的研究表明，cas12f1具有自主性的rnase活性，该活性不依赖于靶标核酸或sgrna的激活，其蛋白本身自主存在。这使得如果结合使用crispr-cas13a和crispr-cas12a两种系统，cas13a反式rnase活性与cas12f1自主rnase活性相互干扰，导致错误的检测结果。

4、如何消除cas12f1自主rnase活性而只保留可激活的反式dnase活性，是crispr-cas13a和crispr-cas12a能结合使用的前提。

技术实现思路

1、为了克服上述技术问题，本发明提供了一种检测灵敏度、准确性更好以及检测时间短的试剂盒以及其使用方法。

2、本发明提供一种cas12f1蛋白突变体，所述cas12f1蛋白突变体在野生型上发生k173a、k186a、k196a、k198a中的一种突变，所述cas12a蛋白突变体的氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示。

3、本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子包含如上所述的cas12f1蛋白突变体的核酸序列，序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示。

4、本发明还提供一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核酸分子。

5、本发明还提供一种crispr-cas12f1系统，所述crispr-cas12f1系统包括第一向导rna和如上所述的cas12f1蛋白突变体。

6、本发明提供的crispr-cas12f1系统用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内rna的非特异性脱靶效应或者制备治疗疾病的药物中的用途。

7、本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一向导rna、如上所述的蛋白突变体和第一检测核酸。

8、本发明还提供一种双重检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂盒包含第一向导rna、如上所述的蛋白突变体、第一检测核酸、第二向导rna、cas13a蛋白和第二检测核酸。

9、进一步的，所述试剂盒中还包括两种不同标记的核酸(ssdna，rna)探针。

10、本发明还提供非疾病诊断目的的对样品中的靶核酸进行双重检测的方法，将样品包括将样品与如上所述的试剂盒中的检测组合物接触，检测由cas蛋白切割核酸探针产生的可检测信号，从而检测靶核酸。

11、进一步的，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

12、进一步的，所述检测探针的5’端和3’端分别设置不同的报告基团

13、进一步的，所述靶核酸来源于病毒核酸、细菌核酸或与疾病相关的特异核酸。

14、进一步的，所述靶核酸包括单链核酸、双链核酸。

15、本发明中的可检测信号可以是当切割检测核酸时产生的任何信号，例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，基于荧光信号的检测，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。

16、本发明中的可检测信号可以是定量的，也可以是定性的。

17、本发明中，检测核酸两端加的标签为分别设置的荧光基团和猝灭基团，当检测核酸被被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。所述荧光基团选自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一种或任意几种。

18、本发明中的双重检测试剂盒用于检测两种不同的靶核酸，试剂盒中所使用的核酸探针也是不同的，第一核酸探针两端分别设置第一荧光基团、第一淬灭基团和第一核酸寡聚物；第二核酸探针两端分别设置第二荧光基团、第二淬灭基团和第二核酸寡聚物。

19、本发明中提供的检测靶核酸的方法可以实现对于样品中核酸的双重检测，第一靶核酸和第二靶核酸的第一靶序列和第二靶序列可以是针对同一靶核酸或同一基因的不同位点设计的靶序列，或者是，针对不同靶核酸或不同基因设计的靶序列。

20、本发明中所述“靶核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。

21、本发明中所述的“grna”又称为guide rna或导向rna，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。grna在不同的crispr系统中，依据其所依赖的cas蛋白的不同，可以包括crrna和tracrrna，也可以只含有crrna。crrna和tracrrna可以经过人工改造融合形成单向导rna(single-guide rna，sgrna)。一般而言，crrna可以包含直接重复序列(directrepeat，dr)和间隔序列(spacer)，或者基本上由或由直接重复序列和间隔序列(spacer)组成。在某些情况下，间隔序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导crispr/cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-30nt的序列长度。所述的直接重复序列和tracrrna可折叠形成特定结构(如茎环结构)供cas蛋白识别，以形成复合物。所述的间隔序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的间隔序列不与核酸探针互补。

22、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

23、1、本发明中的crispr-cas12f1系统(含有突变的cas12f1蛋白k173a、k186a、k196a、k198a)可应用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内rna的非特异性脱靶效应，也可应用于分子检测中，避免检测中错误结果的出现；

24、2、本发明中的crispr-cas12f1系统(含有突变的12f1蛋白k173a、k186a、k196a、k198a)可实现与crispr-cas13a联合使用，互不干扰，用于检测两种不同的靶核酸；

25、3、本发明中发现野生的cas12f1蛋白本身存在rnase活性，并且发现了几个关键位点可以用于抑制rnase活性的关键位点，以此达到与crispr-cas13a联合使用的目的，来达到对于靶核酸双重检测的目的。

26、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。