构建新孢子虫弱毒虫株的方法以及该弱毒虫株在免疫保护方面的应用

本发明属于基因工程，特别涉及构建新孢子虫弱毒虫株的方法以及该弱毒虫株在免疫保护方面的应用。

背景技术：

1、新孢子虫病(neosporosis)是由新孢子虫(neospora caninum)引起的能感染多种动物的原虫病，新孢子虫引发的疾病有全球性分布趋势。该病对牛和犬的危害最为严重，是引起牛流产、产弱胎、死胎、木乃伊胎和犬的神经系统障碍性疾病的主要原因之一，给畜牧业带来严重的经济损失。不同国家和地区所报道的牛新孢子虫病的感染强度存在一定差异，血清抗体阳性率为13.5％～82％。目前，还没有防治新孢子虫病的有效药物和疫苗。因此，研发新孢子虫病疫苗具有重要应用价值。

2、新孢子虫作为一种专性细胞内寄生原虫，其无性生殖阶段有复杂的裂解周期，涉及细胞内和细胞外不同的环境。裂解周期包括入侵宿主细胞、在宿主细胞内的增殖、从宿主细胞逸出，逸出后寻找新的细胞继续入侵。不断循环的裂解周期导致虫体不断增殖，破坏大量宿主细胞，是寄生虫致病的原因之一。在这个周期中，钙离子(ca2+)在入侵、增殖及逸出这些关键过程中的作用必不可少，ca2+信号可以触发参与寄生虫裂解周期中多个分子的激活，对寄生虫的生长和发育变化至关重要。细胞质中ca2+浓度受到高度调控，主要依赖于ca2+通道与钙泵之间的互相协调作用。然而顶复亚门原虫的ca2+通道蛋白与哺乳动物相比，数量和结构差异很大，与钙离子通道相关的蛋白迄今尚未在新孢子虫中的研究报道。

3、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何预防或/和治疗新孢子虫病。

2、为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种调控新孢子虫毒力的方法，所述方法包括通过调控新孢子虫中cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的表达或调控所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的活性或含量，来调控所述新孢子虫毒力；

3、所述cacna1蛋白为下述任一种：

4、a1)、氨基酸序列是seq id no.3所示的蛋白质；

5、a2)、将a1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性且与钙离子通道相关的蛋白质；

6、a3)、在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

7、所述cacna2蛋白为下述任一种：

8、a4)、氨基酸序列是seq id no.6所示的蛋白质；

9、a5)、将a4)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的氨基酸序列具有80％以上同一性且与钙离子通道相关的蛋白质；

10、a6)、在a4)或a5)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

11、其中，seq id no.3由1069个氨基酸残基组成。seq id no.6由258个氨基酸残基组成。

12、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

13、所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。

14、进一步地，所述方法包括下调或降低或抑制新孢子虫中所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的表达或所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的活性或含量，来抑制或降低所述新孢子虫毒力。

15、为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供一种制备毒力降低的新孢子虫的方法，所述方法包括通过下调或降低或抑制新孢子虫中所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的表达或所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的活性或含量，来抑制或降低新孢子虫的毒力，获得毒力降低的基因敲除新孢子虫。

16、进一步地，上述方法包括将靶向cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的编码基因的grna基因以及cas蛋白的编码基因导入所述新孢子虫，下调或降低或抑制新孢子虫中所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的表达或所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的活性或含量。

17、在本发明的一个实施例中，所述cas蛋白为cas9蛋白。

18、进一步地，所述方法中，所述grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.1第692-711位和/或seq id no.4第327-346位。

19、其中靶向cacna1基因的grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.1第692-711位。靶向cacna2基因的grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.4第327-346位。

20、为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供上述方法制备的基因敲除新孢子虫在下述c1)或c2)中的应用，

21、c1)、在制备预防或/和治疗新孢子虫病的产品中的应用；

22、c2)、在预防或/和治疗新孢子虫病中的应用。

23、进一步地，所述的应用中，所述产品可为药物或疫苗。

24、为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供疫苗，所述疫苗的活性成分包括上述方法制备的基因敲除新孢子虫。

25、为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供上述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白或调控基因表达的生物材料或调控所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白活性或含量的生物材料在制备控调新孢子虫毒力的产品中应用或在调控新孢子虫毒力中的应用，所述基因编码所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白。

26、进一步地，所述应用中，所述调控可为下调或降低或抑制。

27、进一步地，所述应用中，所述产品可为试剂或者药物。

28、进一步地，所述应用中，所述试剂可为含有上述蛋白质或/和生物材料的试剂。

29、进一步地，所述应用中，所述药物可用于治疗或预防新孢子虫病。

30、进一步地，所述应用中，所述生物材料为下述任一种：

31、b1)、抑制或降低所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的编码基因的表达或所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的活性的核酸分子；

32、b2)、含有b1)所述核酸分子的表达盒；

33、b3)、含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

34、b4)、含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

35、b5)、含有b1)所述核酸分子的转基因细胞系或含有b2)所述表达盒的转基因细胞系或含有b3)所述重组载体的转基因细胞系；

36、b6)、含有b1)所述核酸分子的转基因组织或含有b2)所述表达盒的动物组织或含有b3)所述重组载体的转基因动物组织；

37、b7)、含有b1)所述核酸分子的转基因器官或含有b2)所述表达盒的转基因动物器官或含有b3)所述重组载体的转基因动物器官；

38、b8)、编码所述cacna1蛋白和/或cacna2蛋白的核酸分子；

39、b9)、含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

40、进一步地，所述应用中，b1)所述核酸分子为表达靶向上述应用中的所述基因的grna的dna分子或为靶向上述应用中的所述基因的grna；

41、进一步地，所述应用中，b8)所述核酸分子为如下g1)-g3)任一项所述的dna分子：

42、g1)、编码链的编码序列是seq id no.2和/或5的dna分子；

43、g2)、编码链的核苷酸序列是seq id no.1和/或4的dna分子；

44、g3)、与g1)或g2)所述dna分子具有80％以上的同一性的dna分子。

45、其中cacna1蛋白的编码基因为cacna1基因，cacna1基因为核苷酸序列是seq idno.1的dna分子，cacna1基因的编码序列为核苷酸序列是seq id no.2的dna分子。cacna2蛋白的编码基因为cacna2基因，cacna2基因为核苷酸序列是seq id no.4的dna分子，cacna2基因的编码序列为核苷酸序列是seq id no.5的dna分子。

46、本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

47、本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

48、进一步地，所述应用中，b1)所述grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.1第692-711位和/或seq id no.4第327-346位。

49、其中靶向cacna1基因的grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.1第692-711位。靶向cacna2基因的grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.4第327-346位。

50、本发明中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或下调或降低或抑制所述蛋白质的编码基因表达的物质。

51、本发明中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

52、本发明中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

53、所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

54、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

55、本发明中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

56、为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供上述应用中的所述蛋白质或/和上述应用中的所述生物材料。

57、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。

58、本文所述微生物可为酵母、细菌或真菌。所述细胞系(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞系具体可为mdbk细胞。

59、术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。

60、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

61、1、本发明提供了降低新孢子虫毒力的方法，通过敲除新孢子虫中cacna1基因和cacna2基因实现新孢子虫毒力的减弱，本发明中首次揭示cacna1和cacna2基因对新孢子虫毒力的调控作用；

62、2、本发明提供cacna1和cacna2双基因敲除的新孢子虫虫株在预防和/或治疗新孢子虫病中的应用，毒力实验表明cacna1和cacna2双基因敲除的新孢子虫虫株对小鼠的致病性显著减弱，经该虫株免疫的小鼠，能够抵抗新孢子虫的再次感染。该虫株具有作为新孢子虫弱毒活疫苗的潜力，为进一步研制新孢子虫病弱毒疫苗奠定基础。