产生成熟肝细胞的方法与流程

本发明涉及产生成熟肝细胞的方法及其组合物。

背景技术：

1、肝细胞负责药物代谢和控制体内的异生物质的消除(gebhardt等人,2003,drugmetab rev 35,145-213；和hewitt等人,2007,drug metab rev 39,159-234)。由于肝细胞在药物、异生物质以及内源性底物的解毒中发挥关键作用，因此被用于药物毒性筛选和开发项目。然而，人原代肝细胞在体外培养时很快丧失其功能。而且，人原代肝细胞的药物代谢能力在不同个体之间表现出显著差异(byers等人,2007,drug metab lett 1,91-95)。

2、除了为药物测试提供新平台外，肝细胞还为肝病患者提供潜在的新疗法。尽管肝移植为终末期肝病提供了有效的治疗，但可行的供体器官的短缺限制了可以用肝细胞治疗的患者群体(kawasaki等人,1998,ann surg 227,269-274；和miro等人,2006,j hepatol44,5140-145)。肝细胞移植和用肝细胞开发的生物-人工肝装置代表了患特定类型肝病的患者的替代救生疗法。鉴于肝细胞的重要功能作用，以及个体代谢特定药物的能力可能存在差异的事实，需要获得成熟且有功能的肝细胞。

3、由于对控制肝细胞成熟的调控途径知之甚少，迄今为止，成熟肝细胞的可重复且有效的产生一直具有挑战性。几乎所有方法都试图在分化培养物中重现肝脏发育的关键阶段，包括诱导确定的内胚层、内胚层对肝脏命运的特化以及肝脏祖细胞的产生。虽然这些早期分化步骤已相当完善，但促进肝细胞成熟的条件尚不清楚。此外，用不同方案产生的群体的成熟状态差异很大，并且代表未成熟肝细胞。

4、因此，本领域需要简单且有效的方法来产生成熟肝细胞。

技术实现思路

1、本发明通过提供通过增加未成熟肝细胞中选自由核因子i x(nfix)和核因子i c(nfic)组成的组的至少一种转录因子的表达来产生成熟肝细胞的有效且高效的方法来满足本领域的这种需要。一个方面，本发明提供了通过增加未成熟肝细胞中选自由核因子i x(nfix)和核因子i c(nfic)组成的组的至少一种转录因子的表达来产生成熟肝细胞的新颖且有效的方法。

2、本发明的方法简单、效率高且有效，并且导致产生可用于本文公开的多种应用，例如治疗肝脏疾病的成熟肝细胞。

3、一个方面，本发明提供了产生成熟肝细胞的方法，该方法包括增加未成熟肝细胞中选自由核因子i x(nfix)和核因子i c(nfic)组成的组的至少一种转录因子的表达，从而生成成熟肝细胞。

4、在一些实施方案中，转录因子是nfix。

5、在一些实施方案中，转录因子是nfic。

6、在一些实施方案中，转录因子是nfix和nfic。

7、在一些实施方案中，nfic是选自由以下组成的组的至少一种选择性剪接的nfic变体：nfic，转录物变体1；nfic，转录物变体2；nfic，转录物变体3；nfic，转录物变体4；和nfic，转录物变体5。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体3。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1和nfic，转录物变体3。

8、在一些实施方案中，该方法进一步包括增加未成熟肝细胞中选自以下组成的组的一种或多种转录因子的表达：rorc、nr0b2、esr1、thrsp、tbx15、hlf、atoh8、nr1i2、cux2、znf662、tshz2、atf5、nfia、nfib、npas2、fos、onecut2、prox1、nr1h4、mlxipl、etv1、ar、cebpb、nr1d1、hey2、arid3c、klf9和dmrta1。

9、在一些实施方案中，该方法进一步包括在包含地塞米松、8-溴腺苷3’,5’-环状单磷酸(8-br-camp)或其组合的培养基中培养未成熟肝细胞。在一些实施方案中，培养进行至少2、3、4、5、6、7、8或9天。在一些实施方案中，8-br-camp的浓度为至少0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8nm或1mm。在一些实施方案中，地塞米松的浓度为至少5nm、10nm、20nm、40nm、60nm、80nm或100nm。

10、在一些实施方案中，增加未成熟肝细胞中至少一种转录因子的表达包括使未成熟肝细胞与至少一种转录因子接触。

11、在一些实施方案中，未成熟肝细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种转录因子的核酸。在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。在一些实施方案中，表达载体是诱导型表达载体。在一些实施方案中，表达载体包含与编码至少一种转录因子的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是内源启动子。在一些实施方案中，启动子是人工启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。

12、在一些实施方案中，增加未成熟肝细胞中至少一种转录因子的表达包括用编码至少一种转录因子的病毒载体转导未成熟肝细胞。

13、在一些实施方案中，增加未成熟肝细胞中至少一种转录因子的表达包括用编码至少一种转录因子的表达载体转染未成熟肝细胞。

14、在一些实施方案中，在增加至少一种转录因子的表达之前将未成熟肝细胞培养至少2、3、4或5天。

15、在一些实施方案中，在增加至少一种转录因子的表达后，将未成熟肝细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8或9天。

16、在一些实施方案中，增加nfix的表达包括相对于未成熟肝细胞中nfix的内源性表达水平增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍。

17、在一些实施方案中，增加nfic的表达包括相对于未成熟肝细胞中nfic的内源性表达水平增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。

18、在一些实施方案中，成熟肝细胞表现出白蛋白(alb)、细胞色素p450酶1a2(cyp1a2)、细胞色素p450酶3a4(cyp3a4)、酪氨酸转氨酶(tat)和/或udp-葡萄糖醛酸转移酶1a-1(ugt1a1)的表达相对于未成熟肝细胞增加。在一些实施方案中，cyp1a2的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，cyp3a4的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，tat的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，ugt1a1的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。

19、在一些实施方案中，成熟肝细胞相对于未成熟肝细胞表现出甲胎蛋白(afp)表达降低。在一些实施方案中，afp的减少的表达包括相对于未成熟肝细胞减少至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍或4倍。

20、在一些实施方案中，相对于未成熟肝细胞，成熟肝细胞表现出白蛋白(alb)分泌增加、afp分泌减少和/或cyp1a2活性增加。在一些实施方案中，alb的增加的分泌包括相对于未成熟肝细胞增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，afp的减少的分泌包括相对于未成熟肝细胞减少至少5％、10％、20％、40％或60％。在一些实施方案中，cyp1a2的增加的活性包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍或400倍。

21、在一些实施方案中，增加至少一种转录因子的表达使未成熟肝细胞的转录组向成熟肝细胞的转录组转变至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。

22、在一些实施方案中，未成熟肝细胞源自多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

23、在一些实施方案中，增加未成熟肝细胞中至少一种转录因子的表达包括使用编码至少一种转录因子的基因开关构建体。在一些实施方案中，基因开关构建体是转录基因开关构建体或转录后基因开关构建体。

24、在一些实施方案中，表达载体进一步包含自切割序列。

25、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

26、在一些实施方案中，nfic包含与由seq id no:2至seq id no:6的核苷酸序列中的任一个编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

27、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:40中所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

28、在一些实施方案中，nfic包含与seq id no:41-seq id no:45中所示的任一氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

29、另一方面，本发明提供了产生多能干细胞来源的成熟肝细胞的方法，该方法包括：(a)将多能干细胞分化为未成熟肝细胞，其中所述多能干细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码由选自由核因子i x(nfix)和核因子i c(nfic)组成的组的至少一种转录因子的核酸，和(b)在未成熟肝细胞中增加来自表达载体的至少一种转录因子的表达，从而生成成熟肝细胞。

30、在一些实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞。

31、在一些实施方案中，多能干细胞是诱导多能干细胞。

32、在一些实施方案中，未成熟肝细胞包含肝母细胞。

33、在一些实施方案中，未成熟肝细胞包含肝干细胞。

34、在一些实施方案中，转录因子是nfix。

35、在一些实施方案中，转录因子是nfic。

36、在一些实施方案中，转录因子是nfix和nfic。

37、在一些实施方案中，nfic是选自由以下组成的组的至少一种选择性剪接的nfic变体：nfic，转录物变体1；nfic，转录物变体2；nfic，转录物变体3；nfic，转录物变体4；和nfic，转录物变体5。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体3。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1和nfic，转录物变体3。

38、在一些实施方案中，该方法进一步包括增加未成熟肝细胞中选自以下组成的组的一种或多种转录因子的表达：rorc、nr0b2、esr1、thrsp、tbx15、hlf、atoh8、nr1i2、cux2、znf662、tshz2、atf5、nfia、nfib、npas2、fos、onecut2、prox1、nr1h4、mlxipl、etv1、ar、cebpb、nr1d1、hey2、arid3c、klf9和dmrta1。

39、在一些实施方案中，该方法进一步包括在包含地塞米松、8-溴腺苷3’,5’-环状单磷酸(8-br-camp)或其组合的培养基中培养未成熟肝细胞。在一些实施方案中，培养进行至少2、3、4、5、6、7、8或9天。在一些实施方案中，8-br-camp的浓度为至少0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8nm或1mm。在一些实施方案中，地塞米松的浓度为至少5nm、10nm、20nm、40nm、60nm、80nm或100nm。

40、在一些实施方案中，未成熟肝细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种转录因子的核酸。

41、在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。

42、在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。

43、在一些实施方案中，表达载体是诱导型表达载体。

44、在一些实施方案中，表达载体包含与编码至少一种转录因子的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是内源启动子。在一些实施方案中，启动子是人工启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。

45、在一些实施方案中，增加未成熟肝细胞中至少一种转录因子的表达包括诱导未成熟肝细胞中至少一种转录因子的表达。在一些实施方案中，诱导未成熟肝细胞中至少一种转录因子的表达包括使用编码至少一种转录因子的基因开关构建体。在一些实施方案中，基因开关构建体是转录基因开关构建体或转录后基因开关构建体。

46、在一些实施方案中，表达载体进一步包含自切割序列。

47、在一些实施方案中，用编码至少一种转录因子的病毒载体转导多能干细胞。

48、在一些实施方案中，用编码至少一种转录因子的表达载体转染多能干细胞。

49、在一些实施方案中，该方法的步骤(a)包括在包含激活素a的第一分化培养基、包含bmp4和fgf2中的至少一种的第二分化培养基和包含hgf的第三分化培养基中培养多能干细胞，从而生成未成熟肝细胞。在一些实施方案中，第一分化培养基、第二分化培养基和第三分化培养基各自培养至少5天。

50、在一些实施方案中，在增加至少一种转录因子的表达之前将未成熟肝细胞培养至少2、3、4或5天。在一些实施方案中，未成熟肝细胞在包含肝细胞生长因子(hgf)的培养基中培养。

51、在一些实施方案中，在增加至少一种转录因子的表达后，将未成熟肝细胞培养至少2、3、4、5、6、7、8或9天。在一些实施方案中，未成熟肝细胞在包含制瘤素-m(osm)的培养基中培养。

52、在一些实施方案中，增加nfix的表达包括相对于未成熟肝细胞中nfix的内源性表达水平增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。

53、在一些实施方案中，增加nfic的表达包括相对于未成熟肝细胞中nfic的内源性表达水平增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。

54、在一些实施方案中，成熟肝细胞表现出白蛋白(alb)、细胞色素p450酶1a2(cyp1a2)、细胞色素p450酶3a4(cyp3a4)、酪氨酸转氨酶(tat)和/或udp-葡萄糖醛酸转移酶1a-1(ugt1a1)的表达相对于未成熟肝细胞增加。在一些实施方案中，cyp1a2的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，cyp3a4的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，tat的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。在一些实施方案中，ugt1a1的增加的表达包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍或10,000倍。

55、在一些实施方案中，成熟肝细胞相对于未成熟肝细胞表现出甲胎蛋白(afp)表达降低。在一些实施方案中，afp的减少的表达包括相对于未成熟肝细胞减少至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、3倍或4倍。

56、在一些实施方案中，相对于未成熟肝细胞，成熟肝细胞表现出白蛋白(alb)分泌增加、afp分泌减少和/或cyp1a2活性增加。在一些实施方案中，alb的增加的分泌包括相对于未成熟肝细胞增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，afp的减少的分泌包括相对于未成熟肝细胞减少至少5％、10％、20％、40％或60％。在一些实施方案中，cyp1a2的增加的活性包括相对于未成熟肝细胞增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍或400倍。

57、在一些实施方案中，增加至少一种转录因子的表达使未成熟肝细胞的转录组向成熟肝细胞的转录组转变至少1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。

58、另一方面，本发明提供了包含通过本文公开的任何一种或多种方法产生的成熟肝细胞群体的组合物。

59、另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含通过本文公开的任何一种或多种方法产生的成熟肝细胞群体和药学上可接受的载体。

60、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

61、在一些实施方案中，nfic包含与由seq id no:2至seq id no:6的核苷酸序列中的任一个编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

62、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:40中所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

63、在一些实施方案中，nfic包含与seq id no:41-seq id no:45中所示的任一氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

64、另一方面，本发明提供了包含肝细胞群体的组合物，所述肝细胞群体包含选自由核因子i x(nfix)和核因子i c(nfic)组成的组的至少一种转录因子的表达水平相对于肝细胞群体中转录因子的内源性表达水平增加。

65、在一些实施方案中，转录因子是nfix。

66、在一些实施方案中，转录因子是nfic。

67、在一些实施方案中，转录因子是nfix和nfic。

68、在一些实施方案中，nfic是选自由以下组成的组的至少一种选择性剪接的nfic变体：nfic，转录物变体1；nfic，转录物变体2；nfic，转录物变体3；nfic，转录物变体4；和nfic，转录物变体5。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体3。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1和nfic，转录物变体3。

69、在一些实施方案中，相对于肝细胞群体中一种或多种转录因子的内源性表达水平，肝细胞进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种转录因子的增加的表达水平：rorc、nr0b2、esr1、thrsp、tbx15、hlf、atoh8、nr1i2、cux2、znf662、tshz2、atf5、nfia、nfib、npas2、fos、onecut2、prox1、nr1h4、mlxipl、etv1、ar、cebpb、nr1d1、hey2、arid3c、klf9和dmrta1。

70、在一些实施方案中，增加的表达包括至少一种转录因子的外源表达。

71、在一些实施方案中，肝细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码至少一种转录因子的核酸。

72、在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、仙台病毒载体和逆转录病毒载体。

73、在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体选自由以下组成的组：质粒dna、线性双链dna(dsdna)、线性单链dna(ssdna)、纳米质粒、微环dna、单链寡脱氧核苷酸(ssodn)、ddna寡核苷酸、单链mrna(ssrna)和双链mrna(dsrna)。在一些实施方案中，非病毒载体包含裸核酸、脂质体、树状聚合物、纳米颗粒、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米颗粒和/或脂质体鱼精蛋白/dna阳离子脂质体(lpd)。

74、在一些实施方案中，表达载体是诱导型表达载体。

75、在一些实施方案中，表达载体包含与编码至少一种转录因子的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是内源启动子。在一些实施方案中，启动子是人工启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。

76、在一些实施方案中，表达载体包含编码至少一种转录因子的基因开关构建体。在一些实施方案中，基因开关构建体是转录基因开关构建体或转录后基因开关构建体。

77、在一些实施方案中，表达载体进一步包含自切割序列。在一些实施方案中，自切割序列选自由t2a、p2a、e2a和f2a组成的组。

78、在一些实施方案中，相对于肝细胞群体中nfix的内源性表达水平，nfix的增加的表达包括增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。

79、在一些实施方案中，相对于肝细胞群体中nfic的内源性表达水平，nfic的增加的表达包括增加至少0.1倍、0.2倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10,000倍。

80、在一些实施方案中，肝细胞群体是未成熟肝细胞群体。

81、在一些实施方案中，肝细胞群体是成熟肝细胞群体。

82、在一些实施方案中，组合物进一步包含非肝细胞。

83、在一些实施方案中，肝细胞群体是类器官的形式。

84、在一些实施方案中，肝细胞源自多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

85、在一些实施方案中，肝细胞群体包含至少106个肝细胞。

86、另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的任何一种或多种组合物的肝细胞群体和药学上可接受的载体。

87、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

88、在一些实施方案中，nfic包含与由seq id no:2至seq id no:6的核苷酸序列中的任一个编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

89、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:40中所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

90、在一些实施方案中，nfic包含与seq id no:41-seq id no:45中所示的任一氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

91、另一方面，本发明提供了包含多能干细胞群体的组合物，该多能干细胞群体包含表达载体，其中该表达载体包含编码选自由核因子i x(nfix)和核因子i c(nfic)组成的组的至少一种转录因子的核酸。

92、在一些实施方案中，转录因子是nfix。

93、在一些实施方案中，转录因子是nfic。

94、在一些实施方案中，转录因子是nfix和nfic。

95、在一些实施方案中，nfic是选自由以下组成的组的至少一种选择性剪接的nfic变体：nfic，转录物变体1；nfic，转录物变体2；nfic，转录物变体3；nfic，转录物变体4；和nfic，转录物变体5。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体3。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1和nfic，转录物变体3。

96、在一些实施方案中，多能干细胞进一步包含表达载体，该表达载体包含编码选自由以下组成的组的一种或多种转录因子的核酸：rorc、nr0b2、esr1、thrsp、tbx15、hlf、atoh8、nr1i2、cux2、znf662、tshz2、atf5、nfia、nfib、npas2、fos、onecut2、prox1、nr1h4、mlxipl、etv1、ar、cebpb、nr1d1、hey2、arid3c、klf9和dmrta1。

97、在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、仙台病毒载体和逆转录病毒载体。

98、在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体选自由以下组成的组：质粒dna、线性双链dna(dsdna)、线性单链dna(ssdna)、纳米质粒、微环dna、单链寡脱氧核苷酸(ssodn)、ddna寡核苷酸、单链mrna(ssrna)和双链mrna(dsrna)。在一些实施方案中，非病毒载体包含裸核酸、脂质体、树状聚合物、纳米颗粒、脂质-聚合物系统、固体脂质纳米颗粒和/或脂质体鱼精蛋白/dna阳离子脂质体(lpd)。

99、在一些实施方案中，表达载体是诱导型表达载体。

100、在一些实施方案中，表达载体包含与编码至少一种转录因子的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是内源启动子。在一些实施方案中，启动子是人工启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。

101、在一些实施方案中，表达载体包含编码至少一种转录因子的基因开关构建体。在一些实施方案中，基因开关构建体是转录基因开关构建体。在一些实施方案中，基因开关构建体是转录后基因开关构建体。

102、在一些实施方案中，表达载体进一步包含自切割序列。在一些实施方案中，自切割序列选自由t2a、p2a、e2a和f2a组成的组。

103、在一些实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

104、在一些实施方案中，多能干细胞群体包含至少106个多能干细胞。

105、另一方面，本发明提供了治疗有需要的受试者中的疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本公开的组合物或药物组合物，从而治疗受试者中的疾病。

106、在一些实施方案中，该疾病选自由以下组成的组：任何原因引起的暴发性肝衰竭、病毒性肝炎、药物诱导的肝损伤、肝硬化、遗传性肝功能不全(如威尔逊病、吉尔伯特综合征、或α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、肝胆癌、自身免疫性肝病(例如自身免疫性慢性肝炎或原发性胆汁性肝硬化)、尿素循环障碍、因子vii缺乏症、糖原贮积病1型、婴儿雷夫苏姆氏病、苯丙酮尿症、严重的婴儿草酸中毒、肝硬化、肝损伤、急性肝衰竭、肝胆癌、肝细胞癌、遗传性胆汁淤积(pfic和alagille综合征)、遗传性血色病、1型酪氨酸血症、精氨基琥珀酸尿症(asl)、克里格勒-纳贾尔综合征、家族性淀粉样多发性神经病、非典型溶血性尿毒症综合征-1、原发性高草酸尿症1型、枫糖尿症(msud)、急性间歇性卟啉症、凝血缺陷、gsd ia型(代谢控制)、纯合子家族性高胆固醇血症、有机酸尿症、以及导致肝功能受损的任何其他病症。

107、另一方面，本发明提供了包含本文所述的组合物或药物组合物的试剂盒。

108、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

109、在一些实施方案中，nfic包含与由seq id no:2至seq id no:6的核苷酸序列中的任一个编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

110、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:40中所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

111、在一些实施方案中，nfic包含与seq id no:41-seq id no:45中所示的任一氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

112、另一方面，本发明提供了包含表达载体的试剂盒，其中该表达载体包含编码选自由核因子i x(nfix)和核因子i c(nfic)组成的组的至少一种转录因子的核酸。

113、在一些实施方案中，转录因子是nfix。

114、在一些实施方案中，转录因子是nfic。

115、在一些实施方案中，转录因子是nfix和nfic。

116、在一些实施方案中，nfic是选自由以下组成的组的至少一种选择性剪接的nfic变体：nfic，转录物变体1；nfic，转录物变体2；nfic，转录物变体3；nfic，转录物变体4；和nfic，转录物变体5。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体3。在一些实施方案中，选择性剪接的nfic变体是nfic，转录物变体1和nfic，转录物变体3。

117、在一些实施方案中，试剂盒进一步包含表达载体，该表达载体包含编码选自由以下组成的组的一种或多种转录因子的核酸：rorc、nr0b2、esr1、thrsp、tbx15、hlf、atoh8、nr1i2、cux2、znf662、tshz2、atf5、nfia、nfib、npas2、fos、onecut2、prox1、nr1h4、mlxipl、etv1、ar、cebpb、nr1d1、hey2、arid3c、klf9和dmrta1。

118、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

119、在一些实施方案中，nfic包含与由seq id no:2至seq id no:6的核苷酸序列中的任一个编码的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

120、在一些实施方案中，nfix包含与seq id no:40中所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

121、在一些实施方案中，nfic包含与seq id no:41-seq id no:45中所示的任一氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

122、通过下面的详细描述和附图进一步说明本发明。