用于补体链测序的方法与流程

背景技术：

1、目前，广泛的应用需要快速且廉价的多核苷酸(例如，dna或rna)测序和识别技术。链测序通常涉及使用多核苷酸结合蛋白(诸如解旋酶)来控制多核苷酸通过纳米孔的移动。双链多核苷酸可以通过在通过纳米孔的易位之前分离链以提供单链多核苷酸来确定。双链多核苷酸的两条链可以通过桥接部分(诸如发夹环)连接，以便确保正向(模板)链的易位之后是反向(补体)链的易位。然而，这种发夹连接的多核苷酸的制备会增加样品制备时间并导致有价值分析物的损失。此外，发夹连接的模板和补体多核苷酸链通过纳米孔的易位可能引起该纳米孔另一(反式)侧上的链的重新杂交。这可能会改变易位速率，从而导致较低的测序准确性。

技术实现思路

1、本公开的方面涉及用于使用纳米孔来表征核酸的组合物和方法。本公开部分基于用于增加核酸链的后续测序的方法。还提供了可以在该方法中使用的组合物和系统，该组合物和系统包括例如用于附接至双链多核苷酸和/或系链剂的衔接子。

2、在一些方面，本公开提供了一种方法，其包括：将多条系链添加到包含设置在膜中的纳米孔的孔中，其中添加到该孔中的系链的浓度为至少100nm；使该纳米孔与包含一对非共价结合的单链核酸的双链核酸复合物接触，该一对中的每个单链核酸包含具有前导区的衔接子；以及对该膜施加电势以促进该单链核酸通过该纳米孔的易位。

3、在一些实施例中，一对中的第一核酸和第二核酸各自是dna或rna。在一些实施例中，一对中的第一核酸和第二核酸是彼此互补的。

4、在一些实施例中，一对中的第一单链核酸的衔接子定位在该第一单链核酸的5'端上。在一些实施例中，一对中的第二单链核酸的衔接子定位在该第二单链核酸的5'端上。

5、在一些实施例中，每个前导区包括一个或多个聚dt区段。在一些实施例中，每个前导区包括两个或更多个聚dt区段，任选地，其中聚dt区段中的每个聚dt区段是不连续的。

6、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一个或多个间隔子。在一些实施例中，一个或多个间隔子中的每个间隔子选自isp3c间隔子、ispc9间隔子和ispc18间隔子。

7、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是2'-邻甲基(2'ome)修饰的核苷酸。

8、在一些实施例中，纳米孔是蛋白质纳米孔，任选地，其中该纳米孔是csgg纳米孔。

9、在一些实施例中，系链中的每条系链是脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸。在一些实施例中，系链中的每条系链包含脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸。在一些实施例中，系链中的每条系链包含生育酚。在一些实施例中，系链中的每条系链包含辛基-生育酚。在一些实施例中，添加到孔中的系链的浓度包括约100nm至1μm、500nm至2μm、1μm至10μm或5μm至50μm。

10、在一些实施例中，该方法进一步包括以下步骤：测量指示一对中的第一和第二核酸的易位的特性；获得指示所测量的特性的数据；以及基于所获得的该第一和第二核酸两者的数据来确定双链核酸复合物的特征。

11、在一些实施例中，该方法进一步包括：检测对应于通过纳米孔的离子流的信号，以检测易位通过孔的第一和第二核酸的多核苷酸；识别对应于该一对中的第一核酸的易位的信号和对应于该一对中的该第二核酸的单独易位的顺序信号；以及分析识别到的该信号，从而对双链核酸复合物进行测序。

12、在一些方面，本公开提供了包含双链核酸复合物的系统，每个复合物包含一对非共价结合的单链核酸，该一对中的每个单链核酸包含具有通向设置在膜中的纳米孔的前导区的衔接子，其中跨该膜施加电势以促进该单链核酸通过该纳米孔的易位，并且其中该系统被配置使得一对中的核酸顺序易位通过该纳米孔的可能性大于来自不同对的非共价结合的单链核酸的核酸顺序易位通过该纳米孔的可能性。

13、在一些方面，本公开提供了包含双链核酸复合物的系统，每个复合物包含一对非共价结合的单链核酸，该一对中的每个单链核酸包含具有通向设置在膜中的纳米孔的前导区的衔接子，其中跨该膜施加电势以促进该单链核酸通过纳米孔的易位，并且其中该膜包含多条系链，该多条系链被配置和布置成促进非共价结合的单链核酸对中的成员以至少10％的后续读取频率顺序易位通过该纳米孔。

14、在一些实施例中，一对中的第一核酸和第二核酸各自是dna或rna。在一些实施例中，一对中的第一核酸和第二核酸是彼此互补的。

15、在一些实施例中，一对中的第一单链核酸的衔接子定位在该第一单链核酸的5'端上。在一些实施例中，一对中的第二单链核酸的衔接子定位在该第二单链核酸的5'端上。

16、在一些实施例中，每个前导区包括一个或多个聚dt区段。在一些实施例中，每个前导区包括两个或更多个聚dt区段，任选地，其中聚dt区段中的每个聚dt区段是不连续的。

17、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一个或多个间隔子。在一些实施例中，一个或多个间隔子中的每个间隔子选自isp3c间隔子、ispc9间隔子和ispc18间隔子。

18、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是2'-邻甲基(2'ome)修饰的核苷酸。

19、在一些实施例中，纳米孔是蛋白质纳米孔。在一些实施例中，纳米孔是csgg纳米孔。

20、在一些实施例中，系链中的每条系链是脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸。在一些实施例中，系链中的每条系链包含生育酚。在一些实施例中，系链中的每条系链包含辛基-生育酚。

21、在一些实施例中，一对中的核酸顺序易位通过纳米孔的可能性比来自不同对的非共价结合的单链核酸的核酸顺序易位通过该纳米孔的可能性大至少15％、20％、25％或30％。

22、在一些实施例中，每条系链包含疏水锚定物和包含与该疏水锚定物偶联的多核苷酸的系链接头，其中每个衔接子包含多核苷酸，该多核苷酸的至少一部分与该系链接头的相应部分杂交以形成一段具有长度为约24至30个碱基对的双链多核苷酸。

23、在一些方面，本公开提供了用于使两个非共价结合的分子顺序易位通过纳米孔的方法，该方法包括：接触包含一对非共价结合的单链核酸的双链核酸复合物，该一对中的每个单链核酸包含具有通向设置在膜中的纳米孔的前导区的衔接子，该膜包含在孔中，其中添加到该孔中的系链的浓度为至少1μm；以及向该膜施加电势，其中在施加电势之后，第一单链核酸易位通过该纳米孔，并且当该第一单链核酸易位时，使第二单链核酸与该系链中的存在于该膜上的至少一条系链可逆地结合，并且在该一对中的该第一单链核酸已经完全易位通过该纳米孔之后，使该一对中的该第二单链核酸易位通过该纳米孔。

24、在一些方面，本公开提供了用于使两个非共价结合的分子顺序易位通过纳米孔的方法，该方法包括：提供包含一对非共价结合的单链核酸的双链核酸复合物，该一对中的每个单链核酸包含具有前导区的衔接子；在促进该一对中的第一单链核酸通过该纳米孔的条件下，使(i)中的该双链核酸复合物与设置在包含多条系链的膜中的纳米孔接触，该膜包含在孔中，其中添加到该孔中的系链的浓度为至少1μm；使第二单链核酸与该系链中的存在于该膜上的至少一条系链可逆地结合；以及在该一对中的该第一单链核酸已经完全易位通过该纳米孔之后，使该一对中的该第二单链核酸易位通过该纳米孔。

25、在一些实施例中，一对中的第一核酸和第二核酸各自是dna或rna。在一些实施例中，一对中的第一核酸和第二核酸是彼此互补的。

26、在一些实施例中，每个前导区包括一个或多个聚dt区段。在一些实施例中，每个前导区包括两个或更多个聚dt区段，其中这些聚dt区段中的每个聚dt区段是不连续的。

27、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一个或多个间隔子。在一些实施例中，一个或多个间隔子中的每个间隔子选自isp3c间隔子、ispc9间隔子和ispc18间隔子。

28、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是2'-邻甲基(2'ome)修饰的核苷酸。

29、在一些实施例中，纳米孔是蛋白质纳米孔。在一些实施例中，纳米孔是csgg纳米孔。

30、在一些实施例中，系链中的每条系链是脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸。在一些实施例中，系链中的每条系链包含生育酚，任选地，其中系链中的每条系链包含辛基-生育酚。在一些实施例中，添加到孔中的系链的浓度包括约1μm至5μm、2μm至20μm或10μm至50μm。

31、在一些实施例中，促进该一对中的第一单链核酸通过纳米孔的易位的条件包括跨膜施加电势。

32、在一些实施例中，使该一对中的第二单链核酸易位通过纳米孔包括：通过纳米孔捕获第二单链核酸的前导区。

33、在一些实施例中，该一对中的第二单链核酸紧接该一对中的第一单链核酸之后易位通过纳米孔。

34、在一些实施例中，不是复合物一部分的一种或多种核酸在该一对中的第二单链核酸易位通过纳米孔之前易位通过该纳米孔。

35、在一些实施例中，在第一单链核酸完全易位通过纳米孔之后，该第一单链核酸和第二单链核酸不再非共价结合。

36、在一些实施例中，该方法进一步包括：测量指示该一对中的第一和第二核酸的易位的特性；获得指示所测量的特性的数据；以及基于所获得的该第一和第二核酸两者的数据来确定双链核酸复合物的特征。

37、在一些实施例中，该方法进一步包括：检测对应于通过纳米孔的离子流的信号，以检测易位通过孔的第一和第二核酸的多核苷酸；识别对应于该一对中的第一核酸的易位的信号和对应于该一对中的该第二核酸的单独易位的顺序信号；以及分析识别到的该信号，从而对双链核酸复合物进行测序。

38、在一些方面，本公开提供了双链核酸复合物，该双链核酸复合物包含第一单链核酸和第一衔接子，该第一单链核酸包含第一模板核酸区段，其中该第一衔接子包含前导序列，该前导序列包含至少两个非连续的聚dt区段，其中该第一单链核酸与第二单链核酸非共价结合，该第二单链核酸包含与该第一模板核酸区段互补的第二模板核酸区段，以及第二衔接子，其中该第二衔接子包含前导序列，该前导序列包含至少两个不连续的聚dt区段；以及系链。

39、在一些实施例中，第一模板核酸区段和/或第二模板核酸区段是dna或rna。

40、在一些实施例中，每个前导区包括三个或更多个不连续的聚dt区段。

41、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一个或多个间隔子。在一些实施例中，一个或多个间隔子中的每个间隔子选自isp3c间隔子、ispc9间隔子和ispc18间隔子。

42、在一些实施例中，每个衔接子进一步包含一种或多种经修饰的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是2'-邻甲基(2'ome)修饰的核苷酸。

43、在一些实施例中，系链中的每条系链是脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸。在一些实施例中，系链中的每条系链包含生育酚。在一些实施例中，系链中的每条系链包含辛基-生育酚。

44、在一些方面，本公开提供了一种用于核酸测序的系统，该系统包括：孔，该孔包括设置在膜中的纳米孔；多条系链，其中添加到该孔中的该多条系链的浓度为至少100nm；双链核酸分子，该双链核酸分子包含与互补的第二链杂交的第一链，每条链包含前导序列，该前导序列包含至少两个不连续的聚dt区段。