用于诱导免疫耐受的合成蛋白的制作方法

背景技术：

1、当受体的免疫系统攻击捐献的移植物并开始破坏移植的组织或器官时，就会发生移植排斥。目前，慢性全身免疫抑制是唯一可用于预防同种异体移植排斥的临床策略(1)。尽管移植后免疫抑制治疗取得了显着进步，但长期抑制宿主免疫反应仍然会导致严重的不良反应，例如机会性感染，心脏和肾脏毒性，以及恶性肿瘤风险增加(2)。这些副作用以及尸体来源的细胞和组织的严重短缺是阻碍同种异体移植疗法广泛适用于治疗多种人类末期疾病的主要障碍(1、3～5)。例如，胰岛移植是治疗1型糖尿病(t1d)的一种有前途的疗法(6～8)。但不幸的是，大多数同种异体胰岛移植物受者在移植后3～5年内失去移植物功能和胰岛素依赖性(9)。此外，尚未建立防止异种移植排斥的免疫抑制方案。因此，对于以更安全和更有效的手段诱导对同种异体或异种移植物的免疫耐受仍然存在关键且未满足的需求。

技术实现思路

1、本发明提供了基于发明人的融合蛋白(本文称为pido)的工程化融合多肽。该融合蛋白从n端到c端包含：(a)包含pd-l1蛋白胞外结构域的至少一部分的pd-l1肽，(b)跨膜结构域，以及(c)包含ido蛋白的至少一部分的ido肽。在一些实施方案中，pd-l1肽能够结合pd-1并且ido肽具有催化活性。

2、在第二方面，本发明提供了核酸构建体，其包含可操作地连接至启动子的编码本文所述融合蛋白的多核苷酸。

3、在第三方面，本发明提供了包含本文所述的核酸构建体的细胞。在合适的条件下，该细胞表达本文所述的融合蛋白。

4、在第四方面，本发明提供将本文描述的细胞移植到受试者体内的方法。

技术特征：

1.一种融合蛋白，其从n端到c端包含：

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述pd-l1肽与seq id no:3或seq id no:7具有至少95％的同一性。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述pd-l1肽还包含pd-l1信号肽。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，所述pd-l1信号肽是seq id no:4或seq idno:8。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的融合蛋白，其中，所述跨膜结构域包含pd-l1蛋白的跨膜结构域的至少一部分。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述跨膜结构域与seq id no:5或seq idno:9具有至少95％的同一性。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的融合蛋白，其中，所述ido肽与seq id no:10具有至少95％的同一性。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的融合蛋白，其中，所述跨膜结构域通过接头肽与所述ido肽连接。

9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中，所述接头肽是甘氨酸-丝氨酸接头。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述甘氨酸-丝氨酸接头是3x gggs接头(seq id no:11)。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含seq idno:1、seq id no:14、seq id no:17或seq id no:20。

12.一种核酸构建体，其包含编码权利要求1～11中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。

13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其中，所述启动子是延伸因子1α短(efs)启动子或杂合cmv增强子/鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。

14.根据权利要求12或13所述的核酸构建体，其中，所述核酸构建体是病毒载体。

15.根据权利要求14所述的核酸构建体，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。

16.一种细胞，其包含权利要求12～15中任一项所述的核酸构建体。

17.根据权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞表达根据权利要求1～11中任一项所述的融合蛋白。

18.根据权利要求17所述的细胞，其中，所述融合蛋白的至少一部分被表达于细胞表面上。

19.根据权利要求17或18所述的细胞，其中，所述pd-l1肽定位于细胞外空间并且所述ido肽定位于所述细胞的细胞质中。

20.根据权利要求16～19中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是胰岛、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、视网膜色素上皮细胞、多巴胺能神经元或心肌细胞。

21.一种将根据权利要求16～20中任一项所述的细胞移植到受试者体内的方法。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述细胞是同种异体来源。

23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述细胞是异种来源。

24.根据权利要求21～23中任一项所述的方法，其中，所述细胞来自猪。

25.根据权利要求21～24中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。

26.根据权利要求21～25中任一项所述的方法，其中，所述移植的细胞发挥其天然功能。

27.根据权利要求21～26中任一项所述的方法，其中，所述移植的细胞在缺少免疫抑制的情况下被免疫系统耐受。

28.根据权利要求21～27中任一项所述的方法，其中，所述移植的细胞相对于缺乏所述核酸构建体的移植的对照细胞具有延长的存活。

29.根据权利要求21～28中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有糖尿病并且所述细胞是胰岛。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述受试者患有i型糖尿病。

31.根据权利要求29或30所述的方法，其中，所述细胞在移植后产生胰岛素。

32.根据权利要求29～31中任一项所述的方法，其中，所述受试者在移植后表现出与移植前相比改善的葡萄糖耐量。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述受试者在移植后变得血糖正常。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述受试者在移植后至少50周保持血糖正常。

技术总结
本发明提供了诱导局部免疫耐受的融合蛋白。该融合蛋白包含源自于免疫调节蛋白程序性死亡配体‑1(PD‑L1)和吲哚胺2,3‑双加氧酶(IDO)的肽。还提供了编码所述融合蛋白的核酸构建体、包含所述核酸构建体的细胞、以及将所述细胞移植到受试者体内的方法。

技术研发人员：雅克·加利波,巴育·保罗
受保护的技术使用者：威斯康星校友研究基金会
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4