具有糖代谢活性的乳酸菌活菌的检测方法与流程

本发明涉及一种含有乳酸菌的饮食品中含有的具有糖代谢活性的乳酸菌活菌的检测方法。

背景技术：

1、乳酸菌带来肠道调节作用等各种生理效应，因此作为酸奶、乳酸菌饮料被广泛食用。为了得到这些生理效应，确保规定的活菌数、维持产品中的活菌数非常重要。另外，为了控制乳酸菌产生的酸对产品风味的影响等，活菌数的管理也成为重要的要点，因此寻求一种迅速测定乳酸菌的活菌数的方法。

2、作为测定乳酸菌的活菌数的方法，有在乳酸菌可生长繁殖的琼脂培养基涂布含有乳酸菌的检体，并对培养而得到的菌落进行计数的方法，但到能够测定为止耗费十几小时～几天，因此存在到得到活菌数的结果为止出现时滞的问题点(专利文献1)。

3、另外，还已知有使用通过用酯酶分解而显示荧光的试剂(羧基荧光素二乙酸酯：cfda)和调查细胞膜损伤的试剂(碘化丙啶，propidium iodide：pi)的双重染色法的以酯酶活性和细胞膜通透性为指标的活性菌的检测方法(该方法中，将由cfda被分解而形成的cf染色(cf+)且没有膜损伤(pi－)的菌作为活性菌)，但在低温的发酵乳中这样的环境下，即便是死菌，有时也会维持细胞膜、酯酶活性，该方法中有时无法测定活菌(非专利文献1)。

4、此外，还报道了许多利用能够仅对活菌或死菌进行染色的试剂的测定方法，但要求更简便且灵敏度高的方法。

5、现有技术文献

6、专利文献

7、专利文献1：日本特开平4－218392号公报

8、非专利文献

9、非专利文献1:lahtinen sj,ouwehand ac,reinikainen jp,korpela jm,sandholm j,salminen sj.2006.intrinsic properties of so-called dormantprobiotic bacteria,determined by flow cytometric viability assays.applenviron microbiol 72:5132-4

技术实现思路

1、本发明所要解决的课题在于提供一种能够迅速测定含有乳酸菌的饮食品中的乳酸菌活菌的方法。

2、本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现通过在含有乳酸菌的饮食品中添加通过用酯酶分解而显示荧光的试剂和判定细胞膜损伤的试剂后，使其以特定量以上存在具有醛基的六碳糖，接着检测向菌体外排出荧光物质且没有细胞膜损伤的乳酸菌，由此能够迅速检测具有糖代谢活性的乳酸菌活菌，完成了本发明。另外，发现利用上述见解能够挑选糖代谢活性高的乳酸菌，进而利用该见解能够进行乳酸菌的耐酸性的预测、低温保存后的存活性的预测，完成了本发明。

3、即，本发明是一种含有乳酸菌的饮食品中含有的具有糖代谢活性的乳酸菌活菌的检测方法，其特征在于，包括以下的工序(a)～(c)：

4、(a)在含有乳酸菌的饮食品中添加通过用酯酶分解而显示荧光的试剂和判定细胞膜损伤的试剂的工序，

5、(b)将含有乳酸菌的饮食品中含有的具有醛基的六碳糖调整为0.01mm以上的工序，

6、(c)从含有乳酸菌的饮食品中检测排出荧光性物质且没有细胞膜损伤的乳酸菌工序。

7、另外，本发明是一种糖代谢活性高的乳酸菌活菌的选择性检测方法，其特征在于，包括以下的工序(d)～(f)：

8、(d)在含有乳酸菌的检体中添加通过用酯酶分解而显示荧光的试剂和判定细胞膜损伤的试剂的工序，

9、(e)将检体中的具有醛基的六碳糖调整为0.01mm以上的工序，

10、(f)在工序(e)之后10分钟以内从检体中检测排出荧光性物质且没有细胞膜损伤的乳酸菌的工序。

11、进而，本发明是检体中含有的乳酸菌的耐酸性的预测方法或检体中含有的乳酸菌的低温保存后的存活性的预测方法，其特征在于，使用上述选择性检测方法。

12、根据本发明，能够迅速(在培养中实时)检测带来各种生理效应，并且对发酵产品的酸度造成影响的具有糖代谢活性的乳酸菌活菌。

13、另外，根据本发明，能够选择性地检测带来各种生理效应，并且对发酵产品的酸度造成影响的糖代谢活性高的乳酸菌活菌。

14、进而，根据本发明，能够进行上述选择性地检测出的乳酸菌的耐酸性的预测、低温保存后的存活性的预测。

技术特征：

1.一种含有乳酸菌的饮食品中含有的具有糖代谢活性的乳酸菌活菌的检测方法，其特征在于，包括以下的工序(a)～(c)：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在工序(b)之后，在60分钟以内进行工序(c)。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，工序(a)中使用的通过用酯酶分解而显示荧光的试剂为羧基荧光素二乙酸酯，判定细胞膜损伤的试剂为碘化丙啶或sytox。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其中，含有乳酸菌的饮食品含有乳成分。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其中，工序(b)中使用的具有醛基的六碳糖为选自葡萄糖、半乳糖和甘露糖中的1种或2种以上。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的检测方法，其中，乳酸菌为属于乳杆菌科的乳酸菌或属于链球菌科的乳酸菌。

7.根据权利要求1～5中任一项所述的检测方法，其中，乳酸菌为属于乳酪杆菌属、乳杆菌属、乳植杆菌属、促生乳杆菌属、联合乳杆菌属以及乳球菌属中的任一者的乳酸菌。

8.根据权利要求1～5中任一项所述的检测方法，其中，乳酸菌为选自副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、短促生乳杆菌、唾液联合乳杆菌以及乳酸乳球菌中的1种或2种以上。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，进一步在含有乳酸菌的饮食品中添加浓度测定用珠来测定乳酸菌的活菌的菌数。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，使珠的浓度为含有乳酸菌的饮食品中含有的粒子的5～70％。

11.一种糖代谢活性高的乳酸菌活菌的选择性检测方法，其特征在于，包括以下的工序(d)～(f)：

12.根据权利要求11所述的糖代谢活性高的乳酸菌的选择性检测方法，其中，工序(d)中使用的含有乳酸菌的检体为除去糖类后的检体。

13.根据权利要求11或12所述的选择性检测方法，其中，工序(d)中使用的通过用酯酶分解而显示荧光的试剂为羧基荧光素二乙酸酯，判定细胞膜损伤的试剂为碘化丙啶或sytox。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的选择性检测方法，其中，在(f)中，将没有细胞膜损伤且荧光物质的排出完毕后的乳酸菌的比例作为纵轴，将调整具有醛基的六碳糖为0.01mm以上后的经过时间作为横轴进行标绘，基于该标绘出的曲线的面积值来进行排出荧光性物质且没有细胞膜损伤的乳酸菌的检测。

15.一种检体中含有的乳酸菌的耐酸性的预测方法，其特征在于，使用权利要求11～14中任一项所述的选择性检测方法。

16.一种检体中含有的乳酸菌的低温保存后的存活性的预测方法，其特征在于，使用权利要求11～14中任一项所述的选择性检测方法。

技术总结
本发明提供一种含有乳酸菌的饮食品中含有的具有糖代谢活性的乳酸菌活菌的检测方法，用于提供一种能够迅速检测含有乳酸菌的饮食品中的乳酸菌活菌的方法，其特征在于，包括以下的工序(a)～(c)：(a)在含有乳酸菌的饮食品中添加通过用酯酶分解而显示荧光的试剂和判定细胞膜损伤的试剂的工序，(b)将含有乳酸菌的饮食品中含有的具有醛基的六碳糖调整为0.01mM以上的工序，(c)从含有乳酸菌的饮食品中检测排出荧光性物质且没有细胞膜损伤的乳酸菌的工序。

技术研发人员：久保田博之,世良田雅纪,奥村刚一
受保护的技术使用者：株式会社益力多本社
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10