用于分析物检测和探针解析的方法和组合物与流程

本公开总体上涉及用于检测样品中的一种或多种分析物的多种分子的方法和组合物。

背景技术：

1、在同时检测多个信号的多重测定中，重要的是每个单独的信号可以彼此区分，以便可以从测定中收集尽可能多的信息。例如，在基于显微术的光学测定中，发射光学信号的单独“斑点”通常需要从样品中的相邻斑点中解析出来。然而，解析大量不同强度的信号仍然具有挑战性，并且需要改进的方法。本公开解决了这些和其他需求。

技术实现思路

1、在原位分析如涉及边杂交边测序(sbh)的那些的过程中，高表达的分析物会产生许多紧挨着的局部扩增探针，从而导致光学拥挤并限制定量的动态范围。大的信号斑点(例如，由于高的分析物丰度)可能彼此重叠和/或掩盖相邻的较小信号斑点，从而使得较小的斑点不可解析。另外，当亮斑点和相对暗的斑点在同一显微镜视场中时，暗斑点可能无法通过后续图像分析的斑点检测阈值。因此，高丰度分析物不仅可能使分析物本身的检测具有挑战性，而且还可能导致无法检测附近的信号斑点和/或同一视场中的较弱信号斑点。因此，需要改进的方法来精确检测和准确定量生物样品中高表达基因的表达水平。在一些方面，本公开涉及用于更准确地检测和定量以高水平存在于样品中的分析物的方法和组合物。

2、在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其包括：(a)使所述生物样品与各自包含靶特异性条形码序列的多种探针接触，其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列，其中所述第一探针靶向生物样品中靶分析物的第一分子，并且所述第二探针靶向生物样品中靶分析物的第二分子，并且靶特异性条形码序列对应于靶分析物；(b)检测与所述多种探针的所述靶特异性条形码序列相关联的多个信号；(c1)检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号；以及(c2)检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号，其中(c1)和(c2)的信号与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针相关联，并分开检测(例如，不同时检测)第一和第二探针解析条形码序列。在一些实施方案中，所述方法还包括(d)使用在步骤(c1)和(c2)中检测到并分别归属于第一和第二探针的信号来解析在步骤(b)中检测到的指示靶分析物的多个信号。

3、在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其包括使生物样品与各自包含靶特异性条形码序列的多种探针接触，其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列。在一些实施方案中，所述多种探针靶向生物样品中的靶核酸，并且靶特异性条形码序列对应于靶核酸或其序列。在一些实施方案中，第一探针靶向生物样品中靶核酸的第一分子，第二探针靶向靶核酸的第二分子，并且靶核酸的第一和第二分子可以在生物样品中的相同位置处或不同位置处。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列是不同的。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列不对应于生物样品中的任何特定靶核酸，而是将第一探针与第二探针区分开，其中两种探针对应于相同的靶核酸。

4、在本文公开的任何实施方案中，方法可还包括检测与所述多种探针的靶特异性条形码序列相关联的多个信号。在本文公开的任何实施方案中，方法可还包括检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号。在本文公开的任何实施方案中，方法可还包括检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号。在一些实施方案中，与所述多种探针的靶特异性条形码序列相关联的多个信号中的每个信号可以与与第一探针解析条形码序列相关联的信号或与第二探针解析条形码序列相关联的信号相关联。例如，生物样品中给定位置处与靶特异性条形码序列相关联(因此与靶分析物如感兴趣的靶核酸相关联)的信号可以作为“斑点”检测到。可以配准“斑点”的位置，并且可以跟踪顺序探针杂交和检测循环中该位置处的信号，将其与来自先前循环的信号关联和/或比较，和/或编译以产生信号签名。因此，与第一或第二探针解析条形码序列相关联的信号可以与靶特异性条形码序列相关联(因此与靶分析物如感兴趣的靶核酸相关联)。然而，与第一或第二探针解析条形码序列相关联的信号仅与包含靶特异性条形码序列的探针的一个子集相关联，并且可以在与其他子集分开的检测通道中检测到。因此，在与单独的靶特异性条形码序列相关联的信号不能在空间上解析成单独的点的情况下，与第一或第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在空间上解析。

5、在本文公开的任何实施方案中，与所述多种探针的靶特异性条形码序列相关联的多个信号可以包含不在空间上解析成单独的点的重叠信号。在本文公开的任何实施方案中，对于与靶特异性条形码序列相关联的重叠信号，每个重叠信号可以与与第一探针解析条形码序列相关联的信号或与第二探针解析条形码序列相关联的信号相关联，但不与两者都相关联，由此将与靶特异性条形码序列相关联的重叠信号解析成分别与第一和第二探针相关联的信号。

6、在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的多个信号可以在生物样品中的多个位置处检测到，与第一探针解析条形码序列相关联的信号可以在所述多个位置的第一子集处检测到，与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在所述多个位置的第二子集处检测到，并且所述多个位置的第一和第二子集不完全重叠。

7、在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的信号、与第一探针解析条形码序列相关联的信号和/或与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以分别使用直接或间接与靶特异性条形码序列或其互补序列、第一探针解析条形码序列或其互补序列、和第二探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针检测，并且任选地检测可以包括滚环扩增(rca)、杂交链反应(hcr)、线型寡核苷酸杂交链反应(lo-hcr)或引物交换反应(per)或它们的任何组合。

8、在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以独立地为约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以为约20个核苷酸，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以为约5个核苷酸。

9、在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针还可以包含锚定序列。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以与靶特异性条形码序列相邻，任选地其中锚定序列可以与靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以在第一和第二探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以在所述多种探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以在靶向生物样品中的不同靶分析物的探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列的长度可以为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸，任选地其中锚定序列的长度可以为约20个核苷酸。

10、在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针还可以包含一个或多个接头序列。在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针可以包含分别侧接第一或第二探针解析条形码序列的两个接头序列。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列中的每一个的长度可以独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在第一和第二探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在所述多种探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在靶向生物样品中相同或不同的靶分析物的探针之间是共同的。

11、在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针解析条形码序列可以与靶特异性条形码序列相邻，任选地其中第一和/或第二探针解析条形码序列可以与靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。

12、在本文公开的任何实施方案中，所述多种探针还可以包括包含第三探针解析条形码序列的第三探针，并且所述方法还可以包括检测与第三探针解析条形码序列相关联的信号。在本文公开的任何实施方案中，所述多种探针还可以包括包含第四探针解析条形码序列的第四探针，并且所述方法还可以包括检测与第四探针解析条形码序列相关联的信号。在本文公开的任何实施方案中，与第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列相关联的信号可以在分开的检测通道如不同的荧光通道中检测到。作为一个实例，可以使针对第一、第二、第三和第四探针解析条形码序列(或其互补序列)的可检测探针同时与生物样品接触，并且与每个探针解析条形码序列相关联的信号可以在红色、绿色、蓝色和黄色荧光通道中的一个中检测到。

13、在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以在靶向相同的靶分析物(例如，靶核酸)的探针之间是不同的。

14、在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以在各自靶向生物样品中的不同靶分析物的两种或更多种探针之间是共同的。在一些情况下，使用共同的探针解析条形码序列使额外的条形码序列的设计负担最小化。在一些情况下，共同的探针解析条形码序列是探针设计的“附加”特征，其提供额外的解析。例如，分别靶向基因x和基因y的第一对探针可以共享共同的第一探针解析条形码序列，分别靶向基因x和基因y的第二对探针可以共享共同的第二探针解析条形码序列，分别靶向基因x和基因y的第三对探针可以共享共同的第三探针解析条形码序列，并且分别靶向基因x和基因y的第四对探针可以共享共同的第四探针解析条形码序列。

15、在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以与相同的生物体物种相关联。在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以与不同的生物体物种相关联。在一些实施方案中，靶分析物的第一分子可以属于第一物种，靶分析物的第二分子可以属于不同于第一物种的第二物种，并且第一和第二探针解析条形码序列可以分别与第一和第二物种相关联。

16、在本文公开的任何实施方案中，靶分析物可以包含核酸序列，并且靶分析物可以任选地为靶dna或rna。在一些实施方案中，所述多种探针可以直接或间接与靶分析物的不同分子中的相同核酸序列结合。在一些实施方案中，所述多种探针中的两种或更多种各自可以直接或间接与靶分析物的不同分子中的不同核酸序列结合。

17、在本文公开的任何实施方案中，第一探针可以包含与靶分析物的第一核酸序列互补的第一靶结合序列，第二探针可以包含与靶分析物的第二核酸序列互补的第二靶结合序列。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以是相同的。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以是不同的。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以与靶分析物中的相同核酸序列杂交。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以与相同核酸分子中的不同、相邻和/或部分重叠的核酸序列杂交。例如，两种或更多种探针可以设计成具有不同的靶序列，这些靶序列平铺(tiled)在相同的核酸分子上。在一些情况下，由于结合效率低下，故靶向相同的核酸分子(例如，靶向平铺在核酸分子上的不同序列)的一种或一些但非全部探针与核酸分子结合。在一些实施方案中，靶分析物中的相邻核酸序列可以是不重叠的或部分重叠的。在一些实施方案中，靶分析物中的相邻核酸序列可以分开0、约5、约10、约15、约20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶分析物中的相邻核酸序列可以在约2、约5、约10、约15、约20或更多个核苷酸处重叠。

18、在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以是环状探针或可环化探针或探针组。在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针可以包含核糖核苷酸，如不多于四个、不多于三个或不多于两个核糖核苷酸。

19、在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以通过使用靶分析物中的核酸序列和/或夹板作为模板的连接而环化。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以是可环化探针，并且可以使用靶分析物中的核酸序列作为模板来连接可环化探针的末端，在连接之前进行或不进行间隙填充。在本文公开的任何实施方案中，可环化探针可以包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且靶分析物可以是dna或rna，任选地其中所述靶分析物为基因组dna、mrna、cdna或报告寡核苷酸(例如，直接或间接与结合剂如抗体偶联的报告寡核苷酸)。在本文公开的任何实施方案中，可环化探针(例如，挂锁探针)可以包含脱氧核糖核苷酸主链中的3’核糖核苷酸。

20、在本文公开的任何实施方案中，连接可以包括酶促连接和/或化学连接，和/或连接可以包括模板依赖性连接和/或非模板依赖性连接。在一些实施方案中，酶促连接可以包括使用具有rna模板化dna连接酶活性和/或rna模板化rna连接酶活性的连接酶。在本文公开的任何实施方案中，酶促连接可以包括使用选自小球藻病毒dna连接酶(pbcv dna连接酶)、t4 rna连接酶、t4dna连接酶和单链dna(ssdna)连接酶的连接酶。在本文公开的任何实施方案中，酶促连接可以包括使用pbcv-1dna连接酶或其变体或衍生物和/或t4 rna连接酶2(t4 rnl2)或其变体或衍生物。

21、在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可以包括在连接之前从生物样品去除未与靶分析物(例如，靶核酸)稳定地结合的第一探针、第二探针和/或夹板的分子的步骤，任选地，去除步骤可以包括一次或多次严格洗涤。

22、在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可以包括在生物样品中原位产生环化的第一探针和环化的第二探针的产物。在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以是使用滚环扩增(rca)产生的扩增产物，任选地rca可以包括线型rca、分支rca、树状rca或它们的任何组合。

23、在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以使用选自以下的聚合酶产生：phi29dna聚合酶、phi29样dna聚合酶、m2 dna聚合酶、b103 dna聚合酶、ga-1dna聚合酶、phi-prd1聚合酶、vent dna聚合酶、deep vent dna聚合酶、vent(外切-)dna聚合酶、klentaq dna聚合酶、dna聚合酶i、dna聚合酶i的klenow片段、dna聚合酶iii、t3 dna聚合酶、t4 dna聚合酶、t5dna聚合酶、t7 dna聚合酶、bst聚合酶、rbst dna聚合酶、n29 dna聚合酶、topotaqdna聚合酶、t7 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶、t3 rna聚合酶及其变体或衍生物。

24、在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以固定在生物样品中和/或与生物样品中的一种或多种其他分子交联。

25、在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括对生物样品成像以通过顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或其组合原位检测产物。

26、在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以是滚环扩增(rca)产物并且可以通过以下方式检测：使所述生物样品与直接或间接与rca产物杂交的一种或多种可检测地标记的探针接触，和使所述一种或多种可检测地标记的探针与rca产物去杂交，任选地所述接触和去杂交步骤可以用所述一种或多种可检测地标记的探针和/或直接或间接与rca产物杂交的一种或多种其他可检测地标记的探针来重复。

27、在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以是滚环扩增(rca)产物并且可以通过以下方式检测：使所述生物样品与直接或间接与rca产物杂交的一种或多种中间探针接触，所述一种或多种中间探针可以是可使用一种或多种可检测地标记的探针检测的，和使所述一种或多种中间探针和/或所述一种或多种可检测地标记的探针与rca产物去杂交，任选地所述接触和去杂交步骤可以用所述一种或多种中间探针、所述一种或多种可检测地标记的探针、一种或多种其他中间探针和/或一种或多种其他可检测地标记的探针来重复。

28、在本文公开的任何实施方案中，所述一种或多种中间探针可以各自包含与rca产物之一杂交的序列和与可检测地标记的探针杂交但不与rca产物杂交的一个或多个突出部。

29、在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括：(i)使所述生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；(ii)对所述生物样品成像以检测步骤(b)的所述多个信号；(iii)任选地从所述靶特异性条形码序列或其互补序列去除所述可检测探针；(iv)使所述生物样品与与所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；(v)对所述生物样品成像以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号；(vi)对所述生物样品成像以在不同于第一检测通道的第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号；以及(vii)任选地从第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列去除可检测探针。

30、在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以包括与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的中间探针和与中间探针杂交的可检测地标记的探针。

31、在本文公开的任何实施方案中，与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以包括与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的中间探针和与中间探针杂交的可检测地标记的探针。

32、在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以用不同于与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的荧光标记的荧光标记直接或间接标记。在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以不包括从靶特异性条形码序列或其互补序列去除可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的检测可以通过使生物样品与：与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触来同时进行。在本文公开的任何实施方案中，对生物样品成像以检测来自与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的多个信号和对生物样品成像以检测与第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号可以按任何次序进行。在本文公开的任何实施方案中，在对生物样品成像以检测与第二探针解析条形码相关联的信号之后可以从生物样品去除与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针。

33、在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以用可在与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的荧光标记相同的荧光通道中检测的荧光标记直接或间接标记。在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括从靶特异性条形码序列或其互补序列去除可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，对生物样品成像以检测与第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号可以按任何次序进行。

34、在本文公开的任何实施方案中，在对生物样品成像以检测与第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号之间，所述方法可以不包括使生物样品与探针接触和去除探针。

35、在本文公开的任何实施方案中，使生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以检测与靶特异性条形码序列相关联的多个信号的步骤和去除可检测探针的任选步骤可以在使生物样品与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号的步骤和对生物样品成像以在第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号的步骤之前进行。替代地，在本文公开的任何实施方案中，使生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以检测与靶特异性条形码序列相关联的多个信号的步骤和去除可检测探针的任选步骤可以在使生物样品与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号的步骤和对生物样品成像以在第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号的步骤之后进行。

36、在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可以包括将接触步骤(与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触)、成像步骤(以检测所述多个信号)、任选的去除步骤(从靶特异性条形码序列或其互补序列去除可检测探针)、接触步骤(与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触)、成像步骤(以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号)、成像步骤(以在第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号)和任选的去除步骤(从第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列去除可检测探针)中的任何一个或多个重复一次或多次，每次使用不同的多种与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和/或使用相同或不同的多种与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针。

37、在一些实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在生物样品中的相同位置处检测到。在一些实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在生物样品中的不同位置处检测到。在一些实施方案中，所述方法还可以包括配准成像步骤的图像以检测与靶特异性条形码序列相关联的多个信号、与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号。在一些实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的多个信号、与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以使用配准图像进行关联。在一些实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的多个信号可以包括在生物样品中的相同位置处或相邻位置处的重叠信号。在一些实施方案中，每个重叠信号可以与与第一探针解析条形码序列相关联的信号或与第二探针解析条形码序列相关联的信号相关联，但不与两者都相关联，从而解析重叠信号。

38、在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其包括：(a)使生物样品与多种环状或可环化探针接触，所述多种环状或可环化探针包括第一环状或可环化探针和第二环状或可环化探针，其中所述第一环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列，并且所述第二环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列，并且其中所述多种环状或可环化探针与生物样品中的不同核酸分子杂交，所述靶特异性条形码序列对应于靶核酸；(b)产生所述第一环状或可环化探针和所述第二环状或可环化探针的滚环扩增(rca)产物；(c)使所述生物样品与在所述靶特异性条形码序列的互补序列处与所述rca产物杂交的可检测探针接触；(d)检测与所述靶特异性条形码序列相关联的信号；(e)使生物样品与在第一探针解析条形码序列的互补序列处与rca产物杂交的可检测探针和与在第二探针解析条形码序列的互补序列处与rca产物杂交的可检测探针接触；以及(f)在分开的检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号。

39、在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是dna或rna。在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是基因组dna、mrna、cdna或靶向生物样品中的靶分析物的探针的报告寡核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二环状或可环化探针可以与相同的靶核酸的不同分子杂交。

40、在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列可以是第一靶特异性条形码序列，靶核酸可以是第一靶核酸，并且所述多种环状或可环化探针还可以包括各自包含对应于与第一靶核酸不同的第二靶核酸的第二靶特异性条形码序列的一种或多种环状或可环化探针。在本文公开的任何实施方案中，所述多种环状或可环化探针可以包括：包含第二靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列的第一环状或可环化探针，以及包含第二靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列的第二环状或可环化探针。

41、在本文公开的任何实施方案中，可检测探针可以包括与rca产物杂交的荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，可检测探针可以包括与rca产物杂交的中间探针和进而与中间探针杂交的荧光标记探针。

42、在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的信号可以包括不在空间上解析成单独的点的重叠信号，例如，与靶特异性条形码序列相关联的信号与与靶特异性条形码序列相关联的一个或多个其他信号不在空间上解析开。在本文公开的任何实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号可以在第一检测通道中检测到并与在第一检测通道中检测到的其他信号在空间上解析开。在本文公开的任何实施方案中，与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在第二检测通道中检测到并与在第二检测通道中检测到的其他信号在空间上解析开。在本文公开的任何实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的空间解析信号和与第二探针解析条形码序列相关联的空间解析信号中的一者或两者可以各自对应于在与靶特异性条形码序列相关联的信号的检测中不在空间上解析的信号。

43、在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其可以包括：(a)使生物样品与各自包含与靶分析物相关联的靶特异性条形码序列的多种探针接触，所述多种探针中的第一探针可以包含与第一生物体物种相关联的第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针可以包含与第二生物体物种相关联的第二探针解析条形码序列，并且其中第一探针可以靶向第一生物体物种的靶分析物的第一核酸序列而第二探针可以靶向第二生物体物种的靶分析物的第二核酸序列，并且靶特异性条形码序列可以对应于靶分析物；(b)检测与所述多种探针的所述靶特异性条形码序列相关联的多个信号；(c1)检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号；以及(c2)检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号，其中步骤(c1)和(c2)的信号与靶分析物相关联。

44、在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列可以分别是第一和第二生物体物种中的靶分析物的同源物。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以是环状或可环化探针或探针组。在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是dna或rna。在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是基因组dna、mrna、cdna或靶向生物样品中的靶分析物的探针的报告寡核苷酸。

45、在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括使生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；和使生物样品与与第一探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触。

46、在本文公开的任何实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在分开的检测通道中检测到。

47、在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，其包含各自包含靶特异性条形码序列的多种探针，其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列，并且其中所述多种探针靶向生物样品中靶分析物(例如，靶核酸)的不同分子，所述靶特异性条形码序列对应于靶分析物。在一些方面，试剂盒还包含直接或间接与靶特异性条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含直接或间接与第一探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含直接或间接与第二探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。

48、在一些实施方案中，用于分析生物样品的试剂盒可以包含多种环状或可环化探针，所述多种环状或可环化探针包括第一环状或可环化探针和第二环状或可环化探针，其中所述第一环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列，所述第二环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列，并且其中所述多种环状和可环化探针与生物样品中的不同核酸分子杂交，所述靶特异性条形码序列对应于靶核酸。在一些方面，试剂盒还可包含与靶特异性条形码序列的互补序列杂交的第一中间探针和与第一中间探针杂交的第一荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含与第一探针解析条形码序列的互补序列杂交的第二中间探针和与第二中间探针杂交的第二荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含与第二探针解析条形码序列的互补序列杂交的第三中间探针和与第三中间探针杂交的第三荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，第二和第三荧光标记探针可以是可在不同的荧光通道中检测的。在本文公开的任何实施方案中，第一荧光标记探针可以是可在与第二荧光标记探针或第三荧光标记探针相同的荧光通道中检测的，并且第一荧光标记探针可以在第二和/或第三荧光标记探针的检测之前从生物样品中去除。替代地，在本文公开的任何实施方案中，第一荧光标记探针可以是可在与第二荧光标记探针或第三荧光标记探针不同的荧光通道中检测的。在这样的情况下，第一荧光标记探针不需要但可以在第二和/或第三荧光标记探针的检测之前从生物样品中去除。

49、在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列可以是第一靶特异性条形码序列，靶核酸可以是第一靶核酸，并且所述多种环状或可环化探针还可以包括各自包含对应于与第一靶核酸不同的第二靶核酸的第二靶特异性条形码序列的一种或多种环状或可环化探针。在一些实施方案中，试剂盒还可包含所述多种环状或可环化探针，其可以包括包含第二靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列的第一环状或可环化探针，以及包含第二靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列的第二环状或可环化探针。