生产维生素B化合物的微生物细胞工厂的制作方法

本发明涉及通过降低和/或消除camp与camp受体蛋白(crp)的结合而具有增加的维生素b化合物产量的基因修饰宿主细胞；提供了camp与crp结合的减少的天然基因和编码多肽的突变体；用于表达此类突变体的遗传构建体；转基因宿主细胞的培养及其用于生产维生素b化合物的用途；包含由这种生产产生的维生素b化合物的发酵液体；包含发酵液的组合物；涉及由此类组合物制备的饮食或药物制剂以及此类组合物和制剂的用途。

背景技术：

1、维生素b化合物，例如生物素(b7)，本质上是由一些微生物和植物产生的。天然生物体中维生素b化合物的生物合成途径一般在本领域中有详细描述。例如，在自然界中，生物素是通过涉及脂肪酸生物合成途径的线性途径合成的(见图6)。大肠杆菌(e.coli)中生物素合成的初始底物是丙二酰-acp，它也是脂肪酸合成的起始代谢物。在进入脂肪酸循环之前，丙二酰-acp被sam(s-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶bioc掩蔽，从而生成丙二酰-acp甲酯。随后，两轮脂肪酸链延长产生庚二酰酯-acp分子。通过专用酯酶bioh水解庚二酰酯-acp的o-甲基，使该分子退出脂肪酸延伸循环。随后，中间体庚二酰酯-acp通过生物素特异性途径转化为生物素。在此途径中，biof催化庚二酰-acp与丙氨酸发生plp依赖性脱羧羟醛缩合，产生kapa(8-氨基-7-氧壬酸)。bioa(和biok)催化kapa的plp依赖性转氨作用以产生dapa(7,8-二氨基壬酸酯)，其中供体是sam；与副产物s-腺苷-蛋氨酸。biod催化atp驱动的dapa羧化和闭环，形成脱硫生物素(dtb)中的噻吩环。生物素合成途径的最后一步是已知的最复杂的生物反应之一，因为它涉及通过生物素合酶(biob)在两个碳氢化合物之间引入硫桥，以产生生物素。

2、此外，硫胺素(b1)本质上是由一些微生物和植物产生的。天然生物体中硫胺素的生物合成途径通常在本领域中有详细描述。例如，在自然界中，硫胺素是通过图7所示的途径合成的。

3、使用基于微生物的细胞工厂是生物合成生产b族维生素的潜在途径(acevedo-rocha等人，2019)。重组微生物(例如大肠杆菌)作为生产生物产品的细胞工厂的优势得到了广泛认可，这是因为以下事实：(i)它具有无与伦比的快速生长动力学；在葡萄糖-盐培养基和最佳环境条件下培养时，倍增时间约为20分钟，(ii)轻松实现高细胞密度；其中大肠杆菌液体培养物的理论密度极限估计约为200g干细胞重量/l或大约1×10^13活细菌/ml。此外，目前还有许多用于大肠杆菌基因改造的分子工具和方案；以及它是一种能够表达异源蛋白质的生物体；两者对于获得所需生物产品的高水平生产可能都是至关重要的。

4、维生素b化合物的细胞生产能力受到许多因素的影响并且在很大程度上在本领域中仅很少描述。wo2019/012058和wo2020/148351公开了突变转录因子iscr有利于脱辅基蛋白通过激活产生生物素合酶(biob)所需的铁硫簇(fes)簇的suf和isc操纵子来改善例如脱硫生物素向生物素的转化和/或有利于脱辅基蛋白通过激活产生磷酸甲基嘧啶合酶(thic)所需的铁硫簇(fes)簇的suf和isc操纵子来改善例如5-氨基咪唑核苷酸(air)向硫胺素的转化。

5、进一步ifuku等人(1995)公开了biob过度表达可以诱导大肠杆菌菌株中的细胞死亡，这可能是由于细胞中fes簇的耗尽和/或活性氧物种(ros)的产生。

6、影响细胞中维生素b化合物产生的另一个因素是细胞的代谢状态。有几种细胞调节蛋白对细胞的代谢状态有很大影响。其中一种蛋白质是转录因子camp受体蛋白(crp)，也称为分解代谢物基因激活蛋白(cap)，当与小分子腺苷3',5'-环单磷酸或环amp(camp，cas号60-92-4)结合时调节大肠杆菌中数百基因的表达。camp由腺苷酸环化酶从三磷酸腺苷(atp)合成。

7、deutscher等人(2006)公开了当葡萄糖供应耗尽，而其他碳源可用时，磷酸转移酶系统(pts)蛋白被磷酸化，导致腺苷酸环化酶(cyaa)被酶iia-glc(crr)激活，从而camp合成，最终形成活性crp-camp复合物。当葡萄糖过量时，pts保持未磷酸化，最终导致低camp和低水平的crp-camp复合物。shimada等人(2011)公开了次级碳源利用涉及的crp-camp激活(除其他外)基因，以及pts/葡萄糖输入基因的转录。shimada等人(2011)进一步公开了估计～400-500个操纵子受到crp-camp复合物的直接控制，包括以下过程：a)碳代谢(糖酵解和糖异生)；b)有氧呼吸(tca循环)；c)氮代谢；d)调节作用(控制许多转录因子)；以及e)应激反应。barth等人(2009)公开了细胞中camp的减少会抑制rpos，rpos是编码替代西格玛因子σs的基因，其激活大肠杆菌中的一般应激反应。basak&jiang(2012)公开了crp活性位点的特定突变使得大肠杆菌能够由于应激反应基因的表达而耐受ros。perrenoud&sauer(2005)表明，cyaa的缺失会影响生物量产量、生长速率、葡萄糖消耗速率、乙酸盐产量、磷酸烯醇丙酮酸水平和丝氨酸水平，而没有观察到对tca循环通量的影响。

8、进一步的背景技术包括：us2006121558，其公开了cyaa的突变影响大肠杆菌中类胡萝卜素的细胞产生；wo2011102305，其公开了cyaa的突变影响肠杆菌科中氨基酸的细胞产生；us20140096439，其公开了cyaa的突变影响酵母中丁醇的细胞生产；au2012202630，其公开了cyaa的突变影响大肠杆菌中类异戊二烯的细胞产生；wo2013003432，其公开了cyaa的突变影响大肠杆菌中琥珀酸的细胞生产；us9932598，其公开了cyaa的突变影响大肠杆菌中碳水化合物的细胞产生；ep3050970，其公开了cyaa的突变影响大肠杆菌和其他生物体中1，4-丁二醇的细胞产生；us20180100169，其公开了cyaa的突变影响大肠杆菌中2,4-二羟基丁酸的细胞产生。wo2021122687指出，环amp水平的增加和导致这种情况的突变增加了宿主细胞中精细化学品的产量，尤其是人乳寡糖的产量。

技术实现思路

1、针对该背景技术，本发明的发明人现已发现，产生经基因修饰以减少camp与crp结合的维生素b化合物的宿主细胞出乎意料地增加了维生素b化合物的产量。本发明人还鉴定了减少camp与crp结合的几种方法(参见图1、图8和图9)，包括删除crp和/或消除和/或降低细胞合成camp以及体内降解camp的能力。预期维生素b化合物产量的增加是由于产生维生素b化合物的途径中关键酶的表达和/或活性增加而引起的，例如用于生物素(维生素b7)的biob、用于硫胺素(维生素b1)的thic、用于喹啉(维生素b3)的nada，用于泛酸(维生素b5)的ilvd，用于钴胺素(维生素b12)的cobg。维生素b3复合物(nr、nam和na)、钴胺素(维生素b12)和泛酸盐(维生素b5)的途径分别如图10、图11和图12所示。所有这些酶都依赖于铁硫(fes)簇，并且被认为是其生物合成途径的瓶颈。此外，设想硫胺素产量的增加是由于产生硫胺素、tmp或tpp的途径中关键酶的表达和/或活性增加而引起的，例如thic、thid、thim、thie、thif、this、thig、thii、thih或thio。具体地，对于硫胺素，本文例如通过thic举例说明，已发现消除或减少crp-camp复合物的量的突变增加了过表达的途径酶的体内活性，例如产生硫胺素hmp-p的嘧啶部分的磷酸甲基嘧啶合酶(thic)，可以被thid磷酸化，然后通过thie与thz-p(噻唑磷酸盐)络合(thz可以添加到培养基中并被thim磷酸化)产生tmp(硫胺素单磷酸)，它可以被异源磷酸酶(atth2)去磷酸化，从而增加微生物细胞工厂中葡萄糖生产硫胺素、tmp或tpp的能力。

2、具体地，对于本文举例说明的维生素b化合物，例如生物素(b7)或硫胺素(b1)，已发现消除或减少crp-环amp复合物的量的突变增加了过表达的途径酶的体内活性，例如生物素合酶(biob)或磷酸甲基嘧啶合酶(thic)，从而增加基于微生物的细胞工厂中从葡萄糖中生产生物素等维生素b化合物。几个基因与调节或催化crp-环amp复合物的形成直接相关，因此有几个不同的基因可以被修改以获得改进的维生素b化合物生产菌株的相同表型。消除或减少细胞中crp-环amp复合物的量的调节作用非常复杂，并且已知可以增加由葡萄糖产生的细胞生物质的产率；然而，令人惊讶地发现，基因修饰的细胞工厂中维生素b化合物产量的提高超过了生物量的增加，即每克生物量维生素b化合物(例如生物素或硫胺素)的产量在生物量增加的基础上得到了提高。虽然改善维生素b化合物(例如biob或thic)途径酶的确切机制尚不清楚，但据信缺乏环amp复合物带来的代谢变化有利于功能性fes负载酶的形成，许多酶促步骤的瓶颈，例如biob、thic、nada、ilvd和cobg分别产生生物素、硫胺素、喹啉、泛酸盐和钴胺素。

3、crp通过与其变构激活剂环amp(camp)结合而天然地作为转录调节剂被激活，camp是由腺苷酸环化酶(由cyaa编码)产生的(图1)。在低葡萄糖条件下，腺苷酸环化酶被葡萄糖特异性酶iia或eiia(由crr编码)的磷酸化状态激活。在高葡萄糖条件下，eiia不会被磷酸化，也不会激活腺苷酸环化酶，从而减少环amp的产生，从而减少活性crp-camp复合物的产生。当crr被缺失时，它不再激活腺苷酸环化酶。当腺苷酸环化酶突变或缺失时，细胞内不能形成camp，当crp突变或缺失时，它不能再与camp结合。在所有情况下，crp-camp复合物都会减少或消除。过表达降解camp的酶(例如camp磷酸二酯酶cpda和camp脱氨酶cadd)也可降低细胞camp水平。

4、因此，在第一方面，本发明提供了基因修饰的宿主细胞，其具有增加的一种或多种维生素b化合物的产量，其中所述宿主细胞通过以下进行基因修饰：

5、a)突变或删除一种或多种天然多核苷酸构建体以减少或消除所述宿主细胞中crp-camp复合物的形成，和/或

6、b)引入一种或多种遗传改变，增加宿主细胞中camp的降解和/或非crp的多肽与camp的结合；

7、由此，与亲本宿主细胞相比，基因修饰的宿主细胞中维生素b化合物的产量增加。

8、在另一方面，本发明提供了与以下至少90％相同的突变多肽：

9、a)突变体crp，其具有seq id no:39中包含的序列并且在对应于seq id no：39的t12、d138、t146、f69、r82、v139、g57、k58、e59、m60、i61、l62、s63、g72、e73、l74、r83、s84、t128、s129、a136、f137、q171、e172、i173、g174、q175、i176、v177、g178、c179、s180、r181、e182、t183、v184、g185和/或r186的一个或多个位置处进一步包含一个或多个突变；

10、b)突变体crr，其具有seq id no:41中包含的序列并且在对应于seq idno:41的h76和/或h91的位置处进一步包含一个或多个突变；

11、c)突变体cyaa，其具有seq id no:43中包含的序列，并且在对应于seq id no:43的g60、k59、l63、t65、r188、g195、k196、r192、s103、s113、d114、d116、w118、e185、t189、k260、k264、k332、w200和/或d300的位置处进一步包含一个或多个突变。

12、在又一个方面，本发明提供了多核苷酸构建体，其包含可操作地连接到一个或多个控制序列的编码camp受体蛋白(crp)、碳水化合物抑制抗性蛋白(crr)或腺苷酸环化酶蛋白(cyaa)的本发明的突变多核苷酸序列。

13、在又一个方面，本发明提供了细胞培养物，其包含本发明的基因修饰的宿主细胞和生长培养基。

14、在又一个方面，本发明提供了包含核酸构建体的基因修饰的宿主细胞。

15、在又一个方面，本发明提供了细胞培养物，其包含本发明的基因修饰的宿主细胞和生长培养基。

16、在又一个方面，本发明提供了生产维生素b化合物的方法，包括：

17、d)在允许宿主细胞产生维生素b化合物的条件下培养本发明的细胞培养物；以及

18、e)任选地回收和/或分离维生素b化合物。

19、在又一个方面，本发明提供了发酵组合物，其包含本发明的细胞培养物和其中包含的维生素b化合物。

20、在又一个方面，本发明提供了包含本发明的发酵组合物和一种或多种载体、试剂、佐剂、添加剂和/或赋形剂的组合物。

21、在最后一个方面，本发明提供了部件套件，包括：

22、a)本发明的基因修饰的细胞及其使用说明；和/或

23、b)本发明的核酸构建体和使用说明；和

24、c)任选地要修饰的细胞。