大豆和玉米无细胞表达系统的制作方法

本公开涉及生物聚合物的体外产生。一些实施例涉及在大豆和玉米无细胞系统中产生例如多肽、多核苷酸和/或多糖。

背景技术：

1、对于在多种应用中使用，相比于常规的体内蛋白质表达系统，无细胞表达系统是更好的。例如，当在活细胞中表达时，许多生物聚合物难以产生、不稳定、有毒或易于裂解性降解。此外，从原核宿主细胞或真核宿主细胞中纯化生物聚合物可能存在安全性问题，例如当宿主细胞通常不被认为是安全的时和/或当难以将生物聚合物与宿主细胞中存在的潜在毒素、过敏原或其他杂质分离时。因此，在一些情况下，对于在生产药物或食品产品中使用，无细胞表达系统是合意的。

2、在农业领域，转基因产物(例如，rna、sirna、基因编辑机器和蛋白质)在作物植物中的表达可以为农民提供极其重要的益处。例如，转基因蛋白提供增加的作物产量、使用更安全和/或更有效的除草剂、减少的对杀虫剂使用的需要、以及通过减少或消除对耕种的需要来保持土壤。然而，转基因在植物中的表达是一个复杂的过程。转基因产物的正确表达(包括合意水平的表达)受到包括基因转录、翻译、蛋白质折叠、糖基化和磷酸化在内的各种复杂过程的影响。这些过程中的每一个都依赖于植物细胞中的不同酶、官能团供体和辅因子。在不同的植物类型中，这些的组合效应可能是不可预测且可变的。因此，为了实现功能性转基因的基因产物的最佳表达，必须选择适当的转录元件(如增强子和启动子)，经常改变转基因编码序列(例如，通过密码子优化)，可以添加、去掉或修饰非编码内含子序列，并且必须考虑和评价植物细胞正确折叠和修饰新翻译的蛋白质(例如，通过连接聚糖或磷酸)的能力以进行确定。

3、与基于转化的植物或组织的表达相比，无细胞蛋白质表达植物系统(“cfps”)提供了诸如更短的加工时间以及直接控制和监测反应条件的优点。swartz(2012)，同上。因此，cfps使得更简单且更快速地筛选大量变量以确定哪些因子实现或改善转基因的基因表达，而无需产生转基因组织/植物(或在产生转基因组织/植物之前)，产生转基因组织/植物可能是劳动密集型、耗时且需要空间的过程。例如，pcr产物可以直接用于同时表达多种蛋白质，而无需费力的克隆和转化步骤。wu等人(2007)angew.chem.int.ed.engl.[德国应用化学英语国际版]46(18)：3356-8；yabuki等人(2007)j.struct.funct.genomics[结构与功能基因组学杂志]8(4)：173-91；gan和jewett(2014)biotechnol.j.[生物技术杂志]9(5)：641-51。cfps平台允许添加促进蛋白质折叠的辅助因子(ozawa等人(2005)j.biomol.nmr[生物分子核磁共振杂志]32(3)：235-41；endo等人(2006)mol.biotechnol.[分子生物技术]33(3)：199-209；matsuda等人(2006)j.struct.funct.genomics[结构与功能基因组学杂志]7(2)：93-100)。它们还促进不能在活细胞中产生的细胞毒性蛋白的表达。xu等人(2005)appl.biochem.biotechnol.[应用生物化学与生物技术]127(1)：53-62；schwarz等人(2008)proteomics[蛋白质组学]8(19)：3933-46；xun等人(2009)protein expr.purif.[蛋白质表达与纯化]68(1)：22-7。

4、大肠杆菌(escherichia coli)无细胞裂解物被广泛使用，并且由于其低成本、可放大性和高生产率而具有优势。zawada等人(2011)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]108(7)：1570-8；caschera和noireaux(2014)biochimie[生物化学]99：162-8。然而，因为裂解物来源于细菌，所以它们由于低效的氧化折叠以及不存在伴侣和糖基化机器而不适合于产生具有多个亚结构域的复杂蛋白质。真核无细胞系统更适合于表达此类蛋白质，并且支持大多数形式的翻译后修饰。chang等人(2005)j.mol.biol.[分子生物学杂志]353(2)：397-409；zhang和kaufman(2006)handb.exp.pharmacol.[实验药理学手册](172)：69-91。最常用的系统基于小麦胚芽提取物(wge)、昆虫细胞提取物(ice)和兔网织红细胞裂解物(rll)。然而，这些系统是昂贵的，并且提取物制备是复杂的。carlson等人(2012)，同上。这产生了对另外的真核cfps的需求，这些另外的真核cfps如基于蜥蜴利什曼原虫(leishmania tarentolae)(mureev等人(2009)nat.biotechnol.[自然·生物技术]27(8)：747-52)、中国仓鼠卵巢(cho)细胞(brodel等人(2014)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]111(1)：25-36)和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)(hodgman和jewett(2013)biotechnol.bioeng.[生物技术与生物工程]110(10)：2643-54；gan和jewett(2014)，同上)的那些。基于植物的无细胞表达系统也描述于美国专利号10,612,031中。

5、然而，关于基因在以下商业上重要的作物植物中的表达，使用前述无细胞系统通常是不合适的或者信息较少：大豆和玉米。大豆(soybean/glycine max)和玉米(maize/zeamays或corn)是世界上种植最多的转基因作物种子。大豆是世界上最大的动物蛋白饲料来源和第二大植物油来源。它也用于食品产品，如酱油和豆腐。根据美国农业部(unitedstates department of agriculture，“usda”)和国际农业生物工程应用技术采购管理局(international service for the acquisition of agri-biotech applications，“isaaa”)的信息，发现经基因修饰的大豆占美国种植的田地的94％，占巴西种植的田地的97％，占加拿大种植的田地的83％，并且占全球种植的大豆田地的78％-82％。基于生产水平，玉米是美国最大的饲料谷物来源，并且是全球最重要的谷物来源。它也用于生产玉米甜味剂和燃料用乙醇。近年来，全球玉米生产水平已经超过10亿公吨/年。发现经基因修饰的玉米占美国田地的92％，并且已经在南美玉米生产国家(如巴西和阿根廷)广泛采用经基因修饰的玉米。

6、为了评价靶基因产物在大豆或玉米中的转基因表达，当前正在在转基因植物组织中(在植物中(in planta)或在植物外(ex planta))进行测试。这种植物组织可以通过稳定或瞬时转化方法产生。虽然稳定转化的植物更可能提供关于转基因表达的可靠、长期且实验可重复的信息，但稳定转化方法可能非常耗时、昂贵且效率非常低。涉及稳定转化的项目可能需要筛选数百或数千种植物以产生和鉴定合适的稳定的转基因植物。相比之下，瞬时转化的植物组织可以更快地产生，有时只需短短几天的时间。然而，可能难以解释瞬时转基因表达的结果，例如因为确定掺入不同组织或不同组织样品中的转基因的数量可能是困难的或不切实际的，这可能使得很难知道转基因表达的差异是否是由于以下方面的差异：(i)转基因构建体，(ii)所表达的转基因产物或(iii)不同组织或组织样品中不同的转基因拷贝数。

7、因此，需要基于大豆和玉米的无细胞表达系统。

技术实现思路

1、本文提供了基于以大豆和玉米无细胞裂解物为基础的反应系统的发现和开发的系统和方法以用于体外合成生物聚合物(例如，多核苷酸、多肽、多糖和复合碳水化合物)。与可能需要数月或更长时间才能执行的基于转基因植物或组织的系统相比，所公开的系统和方法提供了快得多、相对更简单且经济的筛选旨在在大豆或玉米中表达生物聚合物(例如，所编码的rna和/或蛋白质产物)的模板(例如，转基因编码序列和转基因表达构建体)的方式。例如当其他表达系统不能、不适合或不期望用于产生生物聚合物时，所公开的基于大豆或玉米无细胞裂解物的无细胞蛋白质表达系统(cfps)也可以用于表达生物聚合物，如多核苷酸、多肽、多糖和复合碳水化合物。

2、本文描述了一种用于合成生物聚合物的方法，该方法包括将大豆或玉米无细胞裂解物与生物聚合物模板和该生物聚合物的单体单元在反应体积中合并。该生物聚合物模板可以是rna分子，其提供模板以从氨基酸(单体)产生多肽(生物聚合物)。使用dna作为该生物聚合物模板的反应可以用于通过体外复制或转录反应从单体核苷酸产生作为生物聚合物的其他核酸分子(例如，dna和rna)。使用rna作为该生物聚合物模板的反应可以用于在非偶联翻译反应中产生多肽。使用dna作为该生物聚合物模板的反应也可以用于通过偶联转录-翻译反应产生多肽。因此，本文公开了一种用于合成生物聚合物的方法，该方法包括将大豆或玉米细胞裂解物与dna或rna模板和该生物聚合物的单体单元(例如，核酸和/或氨基酸)在反应体积中合并。在特定实例中，该反应体积不包含添加的磷酸肌酸/肌酸激酶能量再生系统，并且在生物聚合物合成反应期间不需要添加磷酸盐或需要添加最少的磷酸盐。

3、在一个方面，本文描述了一种使大豆细胞培养物生长以适合于裂解并且用于所公开的生物聚合物(例如，蛋白质)的无细胞合成的方法。例如，可以使大豆细胞在含有盐、糖、生长素(含或不含细胞分裂素)和维生素的培养基中生长。培养基的实例示于下表1中。在表1中，甘博格(gamborg)是指甘博格b5基础盐混合物+维生素，其可以以2-5g/l(例如，2、3、4或5g/l)的培养基的浓度使用。在表1中，ms是指含有穆拉希吉(murashige)+斯库格(skoog)盐的培养基，其可以以3-6g/l(例如，4-5、4.3、4.4或4.5g/l)的浓度使用。在表1中，蔗糖可以以25-35g/l(例如，25、30或35g/l)的浓度使用。在表1中，生长素可以是2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-d)，其可以以0.2-1.5mg/l(例如，0.2、0.4、.05或1mg/l)的浓度使用，并且生长素还可以包括1-荼乙酸(naa)，其可以以0.2至1mg/l(例如，0.2、0.4-0.6或0.5mg/l)的浓度使用。在表1中，细胞分裂素可以是bap，其以0.02-0.2mg/l(例如，0.02、0.04、0.1或0.2mg/l)的浓度使用。一些培养基可以补充有5-500mg/l(例如，50、100或200mg/l)的肌醇来源，如肌-肌醇(myo-inositol)，含或不含补充量为1-500mg/l(例如，1、50、100或200mg/l)的硫胺素hcl。另外，表1中所示的每种培养基都可以补充有消泡剂，如普朗尼克(pluronic)表面活性剂(例如，cas编号9003-11-6，其为聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)或peg-ppg-peg，平均mn约2,000，可从巴斯夫公司(basf)(美国新泽西州蒙特奥利弗)在溶液中作为普朗尼克l-61获得)，以达到0.0001％至0.0010％(w/v)(例如，0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％(w/v))的最终表面活性剂(peg-ppg-peg)浓度。可以在较大的发酵体积中使用消泡剂。如针对表1所述，可以用大豆细胞接种这种培养基，使这些大豆细胞生长至用于产生裂解物的目标细胞密度。大豆裂解物的目标细胞密度可以是细胞密实体积(packed cell volume，pcv)为15％-30％或20％-25％pcv。

4、表1

5、

6、还提供了一种(i)可以用于根据本文公开的任何方法合成生物聚合物的大豆无细胞裂解物，和(ii)用于通过分离和裂解大豆原生质体来制备这种裂解物的方法。特别地，提供了用于在用于产生大豆原生质体的密度梯度中使用的优选试剂。例如，可以将大豆细胞在生长培养基中培养至目标密度，然后从生长培养基中分离，并且重悬于包括适当的渗透剂和膜稳定剂的原生质体分离溶液中。可以例如通过机械或酶处理来降解经重悬的细胞的细胞壁以产生原生质体，并且可以将经处理的细胞(原生质体)例如使用包含脱液泡(evacuolation)缓冲液中的珀可(percoll)的密度梯度培养基通过密度梯度离心而与液泡分离。这种梯度可以包含3-6个密度层，其范围从0％至高达70％(v/v)的密度梯度培养基。在一个实例中，这种密度梯度包含0、15％、30％、40％和50％(v/v)的密度梯度培养基的层。使脱液泡的原生质体(微小原生质体)富集在密度梯度中的一个或多个层中并且从其中回收这些脱液泡的原生质体，其中将微小原生质体层与含液泡的层物理分离。例如，可以从包括40％珀可密度梯度层的一个或多个层、包括50％珀可密度梯度层的一个或多个层或者包含40％珀可层与50％珀可层的界面的密度梯度部分回收大豆微小原生质体。然后可以将大豆微小原生质体洗涤、裂解(例如，通过匀浆器)并且与大膜分离，以制备适合于在本文公开的任何无细胞生物聚合物合成方法中使用的大豆裂解物。另外，可以将根据本公开制备的大豆裂解物包装在用于合成生物聚合物的试剂盒中。

7、在另一个方面，本文公开了一种使玉米细胞培养物生长以适合于裂解并且用于生物聚合物(例如，蛋白质)的无细胞合成的方法。在一个方面，使玉米细胞在含有盐、糖、生长素(含或不含细胞分裂素)和维生素的培养基中生长。玉米细胞培养基的实例可以包括ms(穆拉希吉+斯库格)盐，浓度为3-6g/l，例如4-5、4.2、4.3、4.4或4.5g/l；蔗糖，可以以25-35g/l(例如，25、30或35g/l)的浓度使用；生长素，如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-d)，可以以0.2-1.5mg/l(例如，0.2、0.4、0.5或1mg/l)的浓度使用；甘博格b5基础盐混合物+维生素，其可以以0.01至5g/l(例如，0.05、0.1、0.2、0.3、0.4g/l、0.5或1g/l)的浓度使用。

8、还提供了(i)一种可以用于根据本文公开的任何方法合成生物聚合物的玉米无细胞裂解物，和(ii)一种用于通过分离和裂解玉米原生质体来制备这种裂解物的方法。特别地，提供了用于在用于产生玉米原生质体的密度梯度中使用的优选试剂。例如，可以将玉米细胞在生长培养基中培养至目标密度，然后从生长培养基中分离，并且重悬于包括适当的渗透剂和膜稳定剂的原生质体分离溶液中。可以例如通过机械或酶处理来降解经重悬的细胞的细胞壁以产生原生质体，并且可以将经处理的细胞(原生质体)例如在珀可、蔗糖或碘海醇(商品名)密度梯度中通过密度梯度离心而与液泡分离。这种梯度可以包含3-6个密度层，其范围从0％至高达60％(v/v)的密度梯度培养基。在一个实例中，这种密度梯度包含0、5％、10％、15％、30％、40％和50％(v/v)的珀可或蔗糖梯度的层。在另一个实例中，这种密度梯度包含从0％至高达30％的碘海醇层。优选地，这种密度梯度包含0、5％、10％、15％和20％碘海醇的层使脱液泡的原生质体(微小原生质体)富集在一个或多个层(其与含液泡的层物理分离)中并且从其中回收这些脱液泡的原生质体，这一个或多个层例如包括10％层的一个或多个层、包括15％10％层的一个或多个层或者包括10％层与15％层的界面的密度梯度部分。然后可以将玉米微小原生质体洗涤、裂解(例如，通过匀浆器)并且与大膜分离，以制备适合于在本文公开的任何无细胞生物聚合物合成方法中使用的玉米裂解物。另外，可以将根据本公开制备的玉米裂解物包装在用于合成生物聚合物的试剂盒中。

9、所公开的细胞裂解物系统可以仅补充有最少量的外源磷酸肌酸、最少量的肌酸激酶或两者，只要该反应体积包含被认为不适合于能量再生系统的量的外源磷酸肌酸和/或肌酸激酶即可。例如，反应体积可以含有添加不超过15mm、不超过10mm、不超过5mm、不超过1mm、不超过500μm、不超过100μm、不超过50μm或不超过10μm的磷酸肌酸。在另一个实例中，反应体积可以含有添加不超过100μg/ml、不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的肌酸激酶。这些量不适合于根据本文公开的方法和系统，因此需要根据本文公开的方法和系统包含细胞器(如质体、线粒体或叶绿体)，以维持生物聚合物合成(包括维持本文公开的延长时间段的生物聚合物合成)。因此，在特定实例中，该反应体积在包含以下的反应体积中包含大豆或玉米细胞裂解物与生物聚合物模板和该生物聚合物的单体单元：(1)添加不超过15mm的磷酸肌酸(也称为磷肌酸(phosphocreatine)或pcr)和添加不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的肌酸激酶(ck)；(2)添加不超过10mm的pcr和添加不超过不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的ck；(3)添加不超过5mm的pcr和添加不超过不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的ck；(4)添加不超过1mm的pcr和添加不超过不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的ck；(5)添加不超过500μm的pcr和添加不超过不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的ck；(6)添加不超过100μm的pcr和添加不超过不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的ck该反应体积可以包含不超过10mm、不超过5mm、不超过1mm；(7)添加不超过50μm的pcr和添加不超过不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的ck；(8)添加不超过10μm的pcr和添加不超过不超过50μg/ml、不超过10μg/ml、不超过5μg/ml、不超过1μg/ml、不超过0.5μg/ml或不超过0.1μg/ml的ck。

10、还公开了用于在不使用人工能量再生系统(即，不添加磷酸肌酸且不添加肌酸激酶)的情况下合成生物聚合物的系统。这种系统的反应体积包含水性大豆或玉米细胞裂解物、(内源或异源)细胞器、生物聚合物模板，并且包括该生物聚合物的单体单元；并且该反应体积不包含添加的磷酸肌酸/肌酸激酶能量再生系统，并且在生物聚合物合成反应期间不需要添加磷酸盐或需要添加最少的磷酸盐。

11、在另一个方面，当存在于本文公开的大豆或玉米裂解物中的氨基酸可以足以支持多肽的延长合成时，该反应体积不需要补充氨基酸来支持多肽合成。

12、本文公开了一种用于合成生物聚合物的试剂盒，该试剂盒包含如本文公开制备的大豆或玉米细胞裂解物。该试剂盒可以进一步包含以下中的一种或多种：(i)用于体外转录或翻译以产生生物聚合物的缓冲液，(ii)该生物聚合物的单体单元，(iii)和/或任选地可以在其中插入(例如，通过分子遗传技术)编码该生物聚合物的模板的载体或构建体。前述一种或多种试剂盒组分可以与说明将这些试剂盒组分与不含磷酸肌酸和肌酸激酶的任何外源组分混合的说明书一起分配在单独的体积容器中。通过进一步举例的方式，试剂盒可以进一步包含诸如镁、钾、核苷、酶(例如，rna聚合酶)和氯霉素的一种或多种组分。该试剂盒的每种组分都可以配置在单独的单个体积中，该单独的单个体积是即用型的或浓缩的(例如，5x或10x，使得它在使用前需要稀释)。用于根据特定实施例合成生物聚合物的试剂盒可以包含本文公开的细胞裂解物(例如，包含叶绿体和/或线粒体)、生物聚合物的单体单元(例如，核苷或氨基酸)和书面说明书。在此类特定实施例中，该书面说明书可以指导用户将这些组分与目的生物聚合物模板(例如，编码多肤的dna或rna分子)和任何其他试剂合并，而无需向该组合中添加磷酸肌酸和/或无需向该组合中添加肌酸激酶(用于能量再生)。

13、本文的方法、系统和试剂盒的实施例在正在进行的合成反应中掺入用于能量再生的活性线粒体，从而可以用于在体外合成的背景下定量研究影响线粒体功能的化合物或蛋白质。此外，可以在合成反应期间利用tca循环的中间体以产生氨基酸，使得延长的多肽合成不需要补充氨基酸。在一些实施例中，用于在本文的方法、系统和试剂盒中使用的大豆或玉米细胞裂解物包含叶绿体，其降低合成反应的氧依赖性。例如，可以从光合活性细胞制备细胞裂解物，使得质体、叶绿体和/或线粒体被保留在该裂解物中，同时去除不期望的细胞材料。在此类具体实例中，本文的方法、系统和试剂盒可以利用质体衍生的能量、线粒体衍生的能量再生、叶绿体衍生的能量再生或两者的组合。

14、在一个方面，所公开的大豆裂解物以及本文公开的相关方法、系统和试剂盒可以用于持续延长的时间段合成生物聚合物(例如，多肽)，这些延长的时间段提供所合成的生物聚合物的增加的产量，包括1小时或更长、2小时或更长、3小时或更长、4小时或更长、5小时或更长、6小时或更长、或7小时或更长、8小时或更长、9小时或更长、10小时或更长、11小时或更长、12小时或更长、13小时或更长、14小时或更长、15小时或更长、16小时或更长、17小时或更长、18小时或更长、19小时或更长、21小时或更长、22小时或更长、23小时或更长或者24小时或更长的延长的时间段。另外，所公开的大豆裂解物以及本文公开的相关方法、系统和试剂盒可以用于合成多肽，产量为25微克/ml(μg/ml)、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、125μg/ml、150μg/ml、175μg/ml、200μg/ml、225μg/ml或500μg/ml的合成反应体积。

15、在另一个方面，所公开的玉米裂解物以及本文公开的相关方法、系统和试剂盒可以用于持续延长的时间段合成生物聚合物(例如，多肽)，这些延长的时间段提供所合成的生物聚合物的增加的产量，包括1小时或更长、1.5小时或更长、2小时或更长、2.5小时或更长、3小时或更长、3.5小时或更长、4小时或更长、4.5小时或更长或者5小时或更长的延长的时间段。此外，所公开的玉米裂解物以及本文公开的相关方法、系统和试剂盒可以用于合成多肽，产量为1微克/ml(μg/ml)、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml或5.5μg/ml的合成反应体积。

16、根据以下参考附图进行的对几个实施例的详细描述，前述和其他特征将变得更加清楚。