用于生产纯度更高的感兴趣的化合物的地衣芽孢杆菌宿主细胞的制作方法

本发明涉及一种用于生产纯度提高的生物化合物的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)宿主细胞。具体地，本发明涉及具有一种或多种遗传修饰的地衣芽孢杆菌，所述遗传修饰选自a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degq、degu、degs、degr和phrg的至少一种基因表达增加的遗传修饰，b)与未修饰的对照细胞相比，导致degs蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及c)与未修饰的对照细胞相比，导致degs蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。本发明还涉及一种基于培养本发明的细菌宿主细胞来生产至少一种纯度提高的感兴趣的化合物的方法。

背景技术：

1、芽孢杆菌(bacillus)属的微生物被广泛用作工业劳动力，用于生产有价值的化合物，如化学品、聚合物和蛋白，特别是蛋白，如洗涤和/或清洁活性酶或者用于饲料和食品应用的酶。这些有用物质的生物技术生产是通过这种芽孢杆菌的发酵和随后的产物纯化来进行的。在各种芽孢杆菌中，地衣芽孢杆菌被广泛用作分泌聚合物(wo2005098016)和蛋白(wo9102792,wo2016180928)的工业生产宿主。

2、芽孢杆菌属的革兰氏阳性微生物已进化出细胞分化、适应和存活机制，以应对不断变化的环境条件，如高温、干旱、水分过剩、营养限制。特别地，菌落内芽孢杆菌细胞的时空不同分化提供了一种生存策略，单个细胞执行不同的功能，如能力发育和群集运动、生物膜形成、胞外降解酶的产生以及合成抗生素和孢子。这些分化过程通过复杂的细胞间信号传导网络进行调节，并通过细胞内信号转导级联进行整合，最终导致差异化的基因表达。

3、在不同的细胞调节子系统中，degs-degu双组分系统控制枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和相关芽孢杆菌的各种细胞过程。反应调节子degu及其同源的传感器激酶degs控制着100多个基因的表达(u.,homuth,g.；2002；molecular genetics andgenomics,268(4),455-467)。因此，degu的磷酸化状态以及细胞内磷酸化的degu(degu-p)的总体水平决定了差异基因表达(verhamme,t.；nicola r.；2007；in:molecularmicrobiology 65(2),s.554–568)。除degs外，degu的磷酸化状态还受几种其他蛋白如degq、degr、rapg和phrg的影响。

4、影响degs-degu双组分系统的几个突变被定位到编码degs/degu系统组分的基因，如degu32(degu-h12l)、degu31(degu-v131l)、degs100(degs v236m)、degs200(degs-g218e)和degs-s76d(degs-s76d)(amory,a.,kunst,f.,aubert,e.,klier,a.,&rapoport,g；(1987)；journal of bacteriology,169(1),324-333.；msadek t,dedonder r；1990；jbacteriol 172(2):824–834)。已经在枯草芽孢杆菌中描述了degq基因的过量表达以增强细胞外酶的产量(us5017477,us5264350)。

5、已对地衣芽孢杆菌生产宿主进行遗传修饰以去除不需要的分泌宿主细胞蛋白(wo2003093453,wo2003087149)，以减少红色素形成(wo2004011609)，或抗生素(wo2003087142,wo2016180928)，从而简化了期望的感兴趣的化合物，特别是分泌的感兴趣的化合物的后续下游纯化过程。

6、地衣芽孢杆菌宿主细胞的优化对于生物化合物的生产具有很高的相关性，即使稍微改进的地衣芽孢杆菌生产宿主也会对大规模工业生产系统和产品纯度产生重大影响。

7、因此，本发明涉及修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其具有减少的宿主细胞蛋白和更高纯度的感兴趣的化合物。

技术实现思路

1、在本发明的基础研究中发现，包含以下遗传修饰的至少一种的地衣芽孢杆菌宿主细胞允许在所述宿主细胞中以更高的纯度有效生产感兴趣的化合物：

2、a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degq、degu、degs、degr和phrg的至少一种基因表达增加的遗传修饰，

3、b)与未修饰的对照细胞相比，导致degs蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及

4、c)与未修饰的对照细胞相比，导致degs蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。

5、因此，本发明涉及这种修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，特别是修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其包含表达盒，用于生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽。

6、因此，在另一实施方案中，本发明涉及一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括

7、a)提供如本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，

8、b)在允许表达感兴趣的所述感兴趣的化合物的条件下培养所述宿主细胞，以及

9、c)任选从培养基分离所述感兴趣的化合物。

技术特征：

1.一种修饰的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)宿主细胞，其包含以下至少一种

2.权利要求1的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的对照细胞相比，a)至c)中任一项的修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞中磷酸化的degu蛋白的水平升高。

3.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的对照细胞相比，所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的formosin d蛋白表达，优选地，其中所述formosin d蛋白包含与seq id no:34具有递增优选的至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。

4.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致选自degq、degu、degs和degr的至少一种基因表达增加的遗传修饰。

5.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致degq基因的表达增加的遗传修饰。

6.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致degq基因的表达增加的遗传修饰，并且其中所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含与未修饰的对照细胞相比，导致degs蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，或者与未修饰的对照细胞相比，导致degs蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。

7.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述导致degs的自磷酸化活性增加的遗传修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞的degs蛋白中的氨基酸取代x76d(根据seq id no:41的编号)。

8.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述导致degs的磷酸酶活性降低的遗传修饰导致地衣芽孢杆菌宿主细胞的degs蛋白中的氨基酸取代x218e(根据seq id no:41的编号)。

9.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述degu基因编码degu蛋白，其包含与seq id no:54具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degs基因编码degs蛋白，其包含与seq id no:41具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degq基因编码degq蛋白，其包含与seq id no:37具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，其中所述degr基因编码degr蛋白，其包含与seq id no:58具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列，并且其中所述phrg基因编码phrg蛋白，其包含与seq id no:62具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列。

10.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述degq基因编码degq蛋白，其包含与seq id no:37具有至少80％、至少90％或100％相同性的氨基酸序列。

11.前述权利要求中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含表达盒，用于生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽。

12.权利要求11的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述感兴趣的多肽是酶，如选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、乳糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶、半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶和纤维素酶的酶。

13.权利要求11和12中任一项的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中与未修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，所述地衣芽孢杆菌宿主细胞包含增加的感兴趣的多肽的产生。

14.一种生产感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的方法，包括

15.一种提高感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽的纯度的方法，包括以下步骤

技术总结
本发明涉及一种用于生产纯度提高的生物化合物的地衣芽孢杆菌宿主细胞。具体地，本发明涉及具有一种或多种遗传修饰的地衣芽孢杆菌，所述遗传修饰选自a)与未修饰的对照细胞相比，导致选自degQ、degU、degS、degR和phrG的至少一种基因表达增加的遗传修饰，b)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的自磷酸化活性增加的遗传修饰，以及c)与未修饰的对照细胞相比，导致DegS蛋白的磷酸酶活性降低的遗传修饰。本发明还涉及一种基于培养本发明的细菌宿主细胞来生产至少一种纯度提高的感兴趣的化合物的方法。

技术研发人员：M·F·费勒,M·阿佩尔鲍姆,C·绍尔,S·耶内魏因
受保护的技术使用者：巴斯夫欧洲公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7