功能强化的新型嵌合抗原受体的制作方法

本发明涉及一种新型嵌合抗原受体、包含其的免疫细胞及其用途，所述新型嵌合抗原受体使用已知在细胞粘附及迁移中起主要作用的cd99l2的部分区域作为嵌合抗原受体的骨架(backbone)。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t(car-t)细胞是一种在从患者血液中分离的t细胞中人工表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；car)的基因导入t细胞(kershaw mh，et al.，natrev immunol.2005；5(12):928-40)，所述嵌合抗原受体为将与肿瘤细胞表面的癌抗原特异性结合的重组抗体(scfv等)区域与t细胞受体的信号传导区进行连接的融合蛋白。当car蛋白质基因以逆转录病毒(retrovirus)或慢病毒(lentivirus)形式导入t细胞时，由于基因导入效率高，2周内50％以上的t细胞的表面表达car蛋白质，从而可在短时间内制备出大量肿瘤特异性t细胞。

2、就制备的car-t细胞而言，当car蛋白质的抗体区识别肿瘤时，通过向t细胞内部传递激活信号来起到杀伤肿瘤的肿瘤杀伤细胞的作用。因此，自2000年代末以来，car-t细胞疗法的临床试验迅速增加(jena b，et al.，blood.2010；116(7):1035-44)。尤其，以作为b淋巴细胞血液肿瘤癌抗原的cd19作为靶标的car-t细胞治疗从初期临床试验开始就显示出令人瞩目的成果。2010年左右，原本在b细胞淋巴瘤中表现出部分效果的cd19 car-t细胞治疗,自从宾夕法尼亚大学的研究小组给出其对现有治疗没有效果的慢性淋巴细胞白血病患者取得完全缓解的报告开始，最近使得对现有所有治疗没有效果的急性淋巴细胞白血病患者30名中的27名在一个月内得到完全缓解，并且能表现出6个月整体存活率达到78％的惊人治疗效果，从而使得所述cd19 car-t细胞治疗呈现出快速增长的趋势，如多家跨国制药公司的大规模投资等(maude sl，et al.，n engl j med.2014；371(16):1507-17)。其结果，两种cd19靶标car-t细胞疗法于2017年末获得美国食品药品监督管理局(fda)认证。

3、目前，car-t细胞开发主要集中在血液肿瘤，并且处于向部分实体瘤扩展的阶段(yip a，webster rm，nat rev drug discov.2018；17(3):161-2)。作为主要血液肿瘤靶标，针对多发性骨髓瘤的抗-b细胞成熟抗原(bcma)car-t细胞疗法处于领先地位，并且对于b淋巴血液肿瘤抗原，除了cd19之外，也正开发针对cd20及cd22等的car-t细胞疗法。针对实体瘤的car-t细胞疗法正在对gd2(脑肿瘤)及间皮素(mesothelin)(胸膜癌)等进行部分临床试验，但尚未报道出显著的功效。推测其原因为，就实体瘤而言，存在多个阻碍car-t细胞的效力的因素。例如，可以理解为：与肿瘤细胞主要分布在血液中而不能很好地生成肿瘤微环境的白血病相比，实体瘤可以构建免疫抵抗性肿瘤微环境，例如，分泌免疫抑制细胞因子(cytokine)(如，tgf-beta及il-10)、或者募集(recruit)免疫抑制细胞(如，调节性t细胞(regulatory t cell)或髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，mdsc))、或者在肿瘤表面表达免疫抑制配体(如，pd-l1)等(rabinovich ga，et al.，annu revimmunol.2007；25:267-96)。因此，为了日后car-t细胞疗法的广泛应用，需要开发一种可克服免疫抑制环境并发挥效力的t细胞活性大幅增加的car-t细胞。

4、增强car-t细胞的功能的一种策略是通过改变car蛋白质自身的结构来增加t细胞激活(dotti g，et al.，immunol rev.2014；257(1):107-26)。car蛋白质设计为识别癌抗原的抗体的可变区(variable region)(单链抗体(single chain variable fragment；scfv))通过骨架区(backbone region；胞外间隔区(extracellular spacer)+跨膜结构域(transmembrane domain))与胞内信号传导区连接的形态。胞内信号传导区主要基于作为t细胞受体(t cell receptor)的信号亚基(subunit)的cd3ζ链(zeta chain)的胞内区(intracellular region)(第一代car)。目前为止，持续通过修饰(modification)car蛋白质来提高car-t细胞的功能，并且其中大部分都以替换或添加共刺激分子(co-stimulatorymolecule)的信号传导区的形式进行(morello a，et al.，cancer discov.2016；6(2):133-46)。例如，目前市售的两种car-t细胞疗法分别使用cd28和41bb共刺激分子的胞内区(第二代car)，而随后尝试同时包含cd28和41bb胞内区的car(第三代car)等。目前市售的诺华公司的卡美莱(kymriah)car-t细胞和吉利德科学公司的阿基仑赛(yescarta)car-t细胞是分别使用41bb和cd28胞内区的第二代car-t细胞。

5、相反地，在car骨架(backbone)区中，cd8、cd28、igg1或igg4的部分区域仅用于物理连接功能，几乎没有被赋予功能要素的示例。因此，通过替换car骨架(backbone)区，可能能够实现一种诱导car-t细胞功能提升的新型修饰。

6、在这种技术背景下，本发明人通过导入使用包含cd99l2蛋白质的跨膜区的区域作为car骨架(backbone)区的新型car设计，探索了改善car-t细胞的肿瘤治疗功效的可能性。结果表明，与现有cd8骨架car(cd8 backbone car)-t细胞相比，cd99l2骨架car-t细胞表现出显著提高的抗肿瘤功效，从而完成了本发明。

7、在本背景技术部分中记载的所述信息仅用于提高对本发明的背景的理解，因此对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，可不包括形成已知现有技术的信息。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种表现出提高的肿瘤治疗效果的嵌合抗原受体及包含其的免疫细胞。

2、本发明的另一目的在于，提供一种编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的表达载体及包含所述表达载体的病毒。

3、本发明的再一目的在于，提供一种包含所述免疫细胞的癌症治疗用组合物、使用所述免疫细胞的癌症治疗方法、所述免疫细胞在癌症治疗中的用途以及所述免疫细胞在制备癌症治疗用药物中的应用。

4、为了实现所述目的，本发明提供一种包含cd99l2蛋白质衍生胞外结构域及跨膜结构域的嵌合抗原受体。

5、本发明还提供一种编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述表达载体的病毒及表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞。

6、本发明还提供一种包含所述免疫细胞的癌症治疗用组合物、使用所述免疫细胞的癌症治疗方法、所述免疫细胞在癌症治疗中的用途以及所述免疫细胞在制备癌症治疗用药物中的应用。