重组酵母细胞的制作方法

本发明涉及一种重组酵母细胞和一种用于生产乙醇的方法，其中使用所述重组酵母细胞。

背景技术：

1、微生物发酵方法适用于从可再生碳水化合物原料工业生产广泛且快速扩大范围的化学化合物。尤其是在厌氧发酵方法中，辅因子对nadh/nad+的氧化还原平衡可能对产物产率造成重大限制。这种挑战的示例为在由酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)工业生产例如燃料乙醇时作为主要副产物的甘油的形成，这是需要再氧化在生物合成反应中形成的nadh的直接结果。

2、按体积计，由酿酒酵母生产乙醇是目前工业生物技术中最大的单一发酵方法。已经提出了多种方法以通过基因修饰来改善工业生物技术中使用的生物体的发酵性质。与基于酵母的乙醇生产的化学计量相关的重大挑战是大量的nadh依赖性副产物(诸如甘油)通常作为副产物形成，尤其是在厌氧和氧气受限的条件下或在呼吸以其他方式受限或不存在的条件下。据估计，在典型的工业乙醇工艺中，高达约4wt.％的糖原料被转化为甘油(nissen等人,"anaerobic and aerobic batch cultivations of saccharomycescerevisiae mutants impaired in glycerol synthesis"[“酿酒酵母突变体的厌氧和好氧分批培养对甘油合成的影响”],(2000),yeast[酵母],第16卷,第463-474页)。在对于厌氧生长理想的条件下，向甘油的转化甚至可能更高，高达约10％。

3、厌氧条件下的甘油生产主要与氧化还原代谢有关。在酿酒酵母(s.cerevisiae)的厌氧生长过程中，经由酒精发酵发生糖异化。在该过程中，在糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成的nadh通过经由nad+依赖性醇脱氢酶将由丙酮酸脱羧形成的乙醛转化为乙醇而被再氧化。当nad+向nadh的净还原发生在代谢的其他地方时，这种氧化还原-中性异化途径的固定化学计量会引起问题。在厌氧条件下，酿酒酵母中的nadh再氧化严格依赖于糖向甘油的还原。甘油形成是通过将糖酵解中间体磷酸二羟丙酮(dhap)还原为甘油3-磷酸(甘油-3p)而引发的，该反应是由nad+依赖性甘油3-磷酸脱氢酶催化的。随后，在该反应中形成的甘油3-磷酸被甘油-3-磷酸酶水解，以产生甘油和无机磷酸。因此，甘油是由酿酒酵母厌氧生产乙醇过程中的主要副产物，这是不期望的，因为它减少了糖向乙醇的总体转化。此外，乙醇生产工厂的流出物中甘油的存在可能增加废水处理的成本。

4、在文献中，已经报道了几种不同的方法，这些方法可以帮助减少副产物甘油的量并且使碳转向至乙醇，使得每克发酵碳水化合物的乙醇产率增加。

5、在wo 2011/010923、wo 2014/081803、wo 2014/129898、wo 2015/107496、wo2015/148272、wo 2018/172328和wo 2018/228836中，已经提出了几种替代还原途径来再氧化所产生的nadh，也称为替代“氧化还原汇(redox sink)”，并且已经将其实施到(重组)酵母细胞中。

6、例如，在wo 2011/010923中，通过提供包含编码nad+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶(ec1.2.1.10)活性的一个或多个重组核酸序列的重组酵母细胞解决了在从含有碳水化合物的原料生产乙醇的方法中的nadh相关副产物(甘油)形成。该细胞可以例如缺乏nadh依赖性甘油合成所需的酶活性，或者与其对应野生型酵母细胞相比，该细胞在nadh依赖性甘油合成方面可以具有降低的酶活性。

7、wo 2014/129898描述了功能性地表达异源核酸序列的重组细胞，这些异源核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(ec 4.1.1.39；在本文中缩写为“rubisco”)和任选地rubisco的分子伴侣以及磷酸核酮糖激酶(ec 2.7.1.19；在本文中缩写为“prk”)。此外，提到了在重组化能营养微生物中使用二氧化碳作为电子受体。

8、尽管所描述的方法和酵母细胞是有利的，但需要持续改进。在工业环境中，以上重组酵母细胞的甘油生产的减少可能潜在地影响它们的耐高渗性和它们对外部环境的应激反应。尤其是在具有挑战性的工艺条件下，例如当应用具有高干固体含量的发酵培养基和/或高发酵温度时，这可能导致在发酵期结束时细胞群体和/或细胞活性的下降。提供这样的方法和用于在其中使用的酵母细胞将是本领域的进步，其中这些酵母细胞在高干固体/高干物质条件和/或高温下具有改善的稳健性。此外，提供在酵母细胞内具有减少的葡萄糖积累和/或总糖含量的酵母细胞将是本领域的进步。也就是说，即使在发酵开始和/或整个发酵过程中存在高浓度的葡萄糖的情况下，在发酵结束时实现酵母细胞的持续性能和/或低浓度的剩余葡萄糖将是本领域的进步。

技术实现思路

1、诸位发明人现在已经出人意料地发现，可以通过使用转酮酶蛋白的特定组合来改进现有技术的方法和酵母细胞。

2、因此，本发明提供了一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞功能性地表达：

3、-编码具有转酮酶活性的天然蛋白的核酸序列；以及

4、-编码具有转酮酶活性的异源蛋白的核酸序列。

5、此外，本发明提供了一种用于生产乙醇的方法，该方法包括使用以上重组酵母细胞转化碳源(诸如碳水化合物或另一种有机碳源)，从而适当地形成乙醇。

6、有利地，使用以上重组酵母细胞和/或以上方法使得稳健性得到改善。当应用具有高干固体含量的培养基时和/或如果应用高发酵温度，这是尤其有利的。

7、从碳源(诸如碳水化合物)生产乙醇的方法可以有利地在存在糖解酶(诸如葡糖淀粉酶)的情况下进行，以将多糖和/或寡糖转化为葡萄糖。当该方法在具有高干物质含量的培养基中进行时，例如在用高浓度玉米醪开始该方法后，培养基中葡萄糖的浓度可能变得非常高。不希望受任何类型的理论的约束，据信高浓度的葡萄糖可能引起酵母细胞的渗透应激，导致酵母细胞停止表现出性能，甚至死亡。

8、不希望受任何类型的理论的约束，据信与不包含所要求保护的转酮酶蛋白的组合的酵母细胞相比，以上重组酵母细胞允许葡萄糖和/或其他糖在酵母细胞内的积累减少，从而适当地允许改善稳健性。

9、通过实例说明优点。在实例中，发酵在36％w/w的高干物质含量下进行。如实例所展示，根据本发明的重组酵母细胞以及根据本发明的方法允许酵母细胞的持续性能和/或葡萄糖的持续转化。即使在包含浓度高达36％w/w的葡萄糖的培养基中和/或高达32℃的温度下，重组酵母细胞在66小时后仍存活并且将碳水化合物转化为乙醇。因此，即使在发酵开始和/或整个发酵过程中存在高浓度的葡萄糖的情况下，在发酵结束时仍可以获得低浓度的剩余葡萄糖。

10、序列表说明

11、本技术含有呈计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。下表1提供了概述。

12、表1：序列表的概述：

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21、

22、在本专利申请的上下文中，每个以上蛋白质/氨基酸序列都优选地由针对在酵母中表达、更优选地针对在酿酒酵母中表达进行密码子对优化的dna/核酸序列编码。