用于制造CDP-胆碱的重组微生物和使用该重组微生物的CDP-胆碱的制造方法与流程

本发明涉及具有生产底物特异性优良的具有合成胞苷二磷酸胆碱的活性的蛋白质的能力的转化体和使用该转化体的高效的胞苷二磷酸胆碱的制造方法。

背景技术：

1、胞苷二磷酸胆碱(cytidine 5’-diphosphate choline；以下记作cdp-胆碱)是作为高等生物的磷脂构成成分的磷脂酰胆碱的生物合成前体，已知有神经保护作用等(非专利文献1)。

2、尽管具有上述有用性，但是cdp-胆碱难以通过来自天然的提取、化学合成来大量得到，主要利用生物所具有的酶反应以胞苷一磷酸(以下称为cmp)、乳清酸为起始原料进行合成(专利文献1和2以及非专利文献2和3)。

3、由乳清酸制造cdp-胆碱时，首先由乳清酸通过多个酶反应合成胞苷三磷酸(以下称为ctp)。接着，在由胆碱通过酶反应合成的磷酸胆碱(以下称为p-胆碱)存在下，通过ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶的作用使所得到的ctp缩合，由此可以合成cdp-胆碱(非专利文献3)。

4、以cmp为起始原料时也同样，由cmp生产ctp，在p-胆碱存在下，通过ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶进行缩合，由此得到cdp-胆碱(非专利文献3)。

5、由以上可知，在利用酶反应的cdp-胆碱的生产中，ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶承担着重要的作用。

6、ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶广泛分布于包括人在内的哺乳类、酵母等真核生物、细菌等中(非专利文献4、5和6)。这些ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶基本上具有由ctp和p-胆碱生成cdp-胆碱的活性。

7、但是，已知存在脱氧胞苷三磷酸(以下记作dctp)时接受dctp作为底物来代替ctp，由dctp和p-胆碱生成脱氧胞苷二磷酸胆碱(以下记作dcdp-胆碱)(非专利文献7)。

8、现有技术文献

9、专利文献

10、专利文献1：国际公开第2003/095660号

11、专利文献2：国际公开第2007/023830号

12、非专利文献

13、非专利文献1：nutrients(2020)vol.12(3)，793，p.1-17

14、非专利文献2：bull.inst.chem.res.kyoto u.(1976)vol.53，p.546-562

15、非专利文献3：appl.microbiol.biotechnol.(2017)vol.101，p.1409-1417

16、非专利文献4：j.bio.chem.(1998)vol.273，p.14022-14029

17、非专利文献5：eur.j.biochem.(1987)vol.169，p.477-486

18、非专利文献6：j.bio.chem.(2002)vol.277，p.4343-4350

19、非专利文献7：eur.j.biochem.(1983)vol.131，p.223-229

技术实现思路

1、发明所要解决的问题

2、dctp作为dna的合成原料，是生命活动所必需的化合物，因此在使用微生物的cdp-胆碱生产中，不能完全抑制dcdp-胆碱的附带产生，成为高效生产cdp-胆碱的障碍。而且，dcdp-胆碱与cdp-胆碱具有极相近的物性，因此难以对它们进行分离。

3、因此，需要显示出与对dctp的反应性相比对ctp的反应性更高的底物特异性的ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶，这样的酶迄今为止尚属未知。另外，对于肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶等而言，虽然晶体结构已被阐明(非专利文献6)，但是对dctp的反应性是无法预测的。

4、本发明的目的在于，提供用于制造cdp-胆碱的重组微生物和使用该重组微生物的cdp-胆碱的制造方法。

5、用于解决问题的方法

6、本发明人对上述课题进行了研究，结果发现了显示出与对dctp的反应性相比对ctp的反应性更高的优良的底物特异性的ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶。进而发现，通过利用具有生产异源的该ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶的能力的重组微生物能够高效地制造cdp-胆碱，基于这些见解完成了本发明。

7、即，本发明涉及以下。

8、1.一种重组微生物，其为具有生产异源的ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶的能力的重组微生物，其中，上述ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶为选自下述的(a1)～(a3)和(b1)～(b3)中的任一多肽。

9、(a1)由序列号10所示的氨基酸序列构成的多肽

10、(a2)由与序列号10所示的氨基酸序列具有至少60％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽

11、(a3)由在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成且具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽

12、(b1)由序列号14所示的氨基酸序列构成的多肽

13、(b2)由与序列号14所示的氨基酸序列具有至少60％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽

14、(b3)由在序列号14所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成且具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽

15、2.根据上述1所述的重组微生物，其中，以能够表达的方式导入了选自下述的(a1)～(a3)和(b1)～(b3)中的任一dna。

16、(a1)编码序列号10所示的氨基酸序列的dna

17、(a2)编码由与序列号10所示的氨基酸序列具有至少60％以上的一致性的氨基酸序列构成且具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽的dna

18、(a3)编码由在序列号10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成且具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽的dna

19、(b1)编码序列号14所示的氨基酸序列的dna

20、(b2)编码由在序列号14所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成且具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽的dna

21、(b3)由与编码序列号14所示的氨基酸序列的dna具有至少60％以上的一致性的dna构成且编码具有ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶活性的多肽的dna

22、3.根据上述1或2所述的重组微生物，其为大肠杆菌。

23、4.根据上述1～3中任一项所述的重组微生物，其中，在将对ctp的反应性设为1时，上述ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶对dctp的反应性为0.75以下。

24、5.一种cdp-胆碱的制造方法，其包括利用上述1～4中任一项所述的重组微生物生成cdp-胆碱的步骤。

25、发明效果

26、本发明的重组微生物具有生产显示出与对dctp的反应性相比对ctp的反应性更高的优良的底物特异性的异源的ctp:磷酸胆碱胞苷酰转移酶的能力。通过利用本发明的重组微生物，可抑制dcdp-胆碱的附带产生、高效地制造cdp-胆碱。