在同源染色体的一方具有特异性的DNA缺失的细胞的制造方法

本发明涉及利用位点特异性切口酶，制造在同源染色体的一方具有特异性的dna缺失的细胞的方法。另外，本发明涉及以该dna缺失为指标评价细胞的同源重组功能的方法。

背景技术：

1、随着talens、crispr-cas系统等可编程的核酸酶的出现，现在，基因组编辑技术正在呈现迅速的发展。cas蛋白质与指导rna形成复合体，该复合体与具有指导rna的互补序列的基因组上的靶标位点结合，切割dna双链的双方。作为上一代的基因组编辑技术的talens是以dna为靶标的tale蛋白质与切割dna的核酸酶(主要为foki)的融合蛋白质，但与crispr-cas系统同样地，在基因组上的靶标位点产生dna的双链切割。

2、该dna的双链切割在通过非同源末端接合而被修复时，产生核苷酸的插入/缺失(insertion/deletion:indel(得失位))，通过移码等而可以进行基因敲除。另一方面，在从细胞外导入成为修复模板的供者dna的情况下，通过基因组与供者dna之间的同源重组，可以进行基因敲入。在该基因敲入中，不仅可以产生dna的插入，还可以产生1～数核苷酸的替换、缺失。

3、然而，从基因组稳定性的观点考虑，使用可编程的核酸酶的基因组编辑存在大问题。其一是由dna的双链切割造成的目的外的基因突变的发生。在体细胞中，与利用同源重组的修复相比，利用非同源末端接合的修复是优势的，因而在被基因组编辑系统进行了双链切割的靶标位点，与利用修复模板的敲入相比，更容易产生目的外的突变(indel，得失位)。因此，在实施了基因组编辑的细胞集团中，除了实现了按照目的的敲入的细胞、完全没有发生基因序列的变化的细胞之外，还包含不少发生了由非同源末端接合引起的目的外的突变的细胞。另外，如果从单细胞水平来看，则即使常染色体的等位基因中的1个按照计划被敲入，另一个也有可能发生了目的外的突变。另外，有可编程的核酸酶在与靶标序列类似性高的dna序列(脱靶)中也产生dna双链切割，从而产生基因组突变的报告。

4、于是，本发明者们通过使用使cas9的2个核酸酶部位中的一个失活了的切口酶型cas9，利用dna的单链切割来诱导同源重组，从而开发了与现有的利用dna的双链切割的方法相比，能够抑制由非同源末端接合造成的目的外的突变(indel，得失位)的发生的方法。其一是通过使用切口酶，在作为靶标的基因组导入2个位置的切口、在包含修复模板的供者质粒导入1个位置的切口，从而利用随机切口法的基因组编辑法(非专利文献1、专利文献1)。另外，本发明者们使该方法进一步发展，还开发了在作为靶标的基因组导入1个位置的切口、在包含修复模板的供者质粒导入1个位置的切口的sngd法(a combination ofsingle nicks in the target gene and donor plasmid)(专利文献1)。

5、另一方面，在基因组编辑中，还存在向作为修复模板使用的供者dna的基因组中的随机整合这样的问题。于是，本发明者们还开发了以细胞中本来存在的同源染色体作为修复模板进行基因组编辑的方法(专利文献2)。通过该基因组编辑，在细胞内的染色体中存在杂合子突变或者复合杂合子突变的情况下，通过在同源染色体之间诱导同源重组，从而可以以不存在该突变的一方的同源染色体作为修复模板，将在另一方的同源染色体中存在的突变修复成正常序列。

6、在治疗在染色体中存在的杂合子突变中，来自突变等位基因的基因产物阻碍来自正常等位基因的基因产物的功能这样的疾病的目的下，除了利用了这样的同源重组的向正常序列的修复以外，还可考虑使包含这些突变的dna区域特异性地缺失。

7、因此，期望开发在抑制目的外的突变发生的同时有效地使同源染色体的一方的特定dna区域缺失的方法。

8、现有技术文献

9、专利文献

10、专利文献1：日本特开2018-11525号公报

11、专利文献2：国际公开2020/100361号公报

12、非专利文献

13、非专利文献1:nakajima k,et al.,genome res.28,223-230,2018

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、本发明是鉴于这样的状况而做出的，其目的在于提供不进行dna的双链切割、并且不使用外来的供者dna、有效地在同源染色体的一方产生特异性的dna缺失的方法。另外，本发明的目的还在于以该dna缺失作为指标，提供评价细胞的同源重组功能的方法。

3、用于解决课题的手段

4、在细胞内的基因存在杂合子突变的情况下，在同源染色体的一方(将此称为“染色体a”)中存在的基因突变，在同源染色体的另一方(将此称为“染色体b”)不存在。这里，如果能够使染色体a上的包含突变的dna区域特异性地缺失，则可能治疗由该突变引起的疾病。

5、本发明者们在同源染色体的突变位点周围以各种方式导入dna的单链切割，结果发现，通过对于染色体a的突变位点的附近dna区域的多个位置在dna两条链或同一dna链上产生切口，并且对于染色体b，在与染色体a上产生切口的位置对应的位置的1个位置产生切口，从而能够有效地从染色体a使超过100bp的dna区域缺失(将该方式的切口导入的例子示于图2、图4)。另外，本发明者们发现，在上述方式中，即使在染色体b不产生切口的情况下，也能够有效地从染色体a使超过100bp的dna区域缺失(将该方式的切口导入的例子示于图3、5)。进而，本发明者们发现，通过使用抑制了参与同源重组的基因(例如，各fanc基因)的功能的细胞，能够使dna区域的缺失的效率提高。

6、根据本发明的方法的原理，能够广泛地以在同源染色体之间不同的碱基作为靶标，仅在同源染色体的一方使超过100bp的dna缺失。另外，根据细胞中的同源重组功能的抑制使dna缺失的效率提高这样的事实，也能够以该dna缺失作为指标，评价细胞中的同源重组功能。

7、本发明是基于这些见解而做出的，更详细地提供以下发明。

8、(1)在由染色体a和染色体b构成的同源染色体中染色体a具有特异性的dna缺失的细胞的制造方法，

9、该方法包括对同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近dna区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，

10、该位点特异性切口酶的组合对于染色体a，在该特定位点的附近dna区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近dna区域的dna两条链或同一dna链上的单链切割，对于染色体b，在与染色体a中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。

11、(2)根据(1)所述的方法，同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞是fanc基因的功能被抑制了的细胞。

12、(3)根据(1)或(2)所述的方法，在同源染色体之间不同的碱基是突变位点的碱基。

13、(4)根据(1)～(3)的任一项所述的方法，位点特异性切口酶是crispr-cas系统。

14、(5)用于在(1)所述的方法中使用的试剂盒，

15、该试剂盒包含对于同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，在该特定位点的附近dna区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，

16、该位点特异性切口酶的组合对于染色体a，在该特定位点的附近dna区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近dna区域的dna两条链或同一dna链上的单链切割，对于染色体b，在与染色体a中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。

17、(6)根据(5)所述的试剂盒，同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞是fanc基因的功能被抑制了的细胞。

18、(7)细胞的同源重组功能的评价方法，

19、该方法包括对由染色体a和染色体b构成的同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近dna区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，检测由此产生的对染色体a特异性的dna缺失，

20、该位点特异性切口酶的组合对于染色体a，在该特定位点的附近dna区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近dna区域的dna两条链或同一dna链上的单链切割，对于染色体b，在与染色体a中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割，

21、在对染色体a特异性的dna缺失产生的频率高于对照的情况下，评价为该细胞的同源重组功能被抑制。

22、(8)根据(7)所述的方法，细胞是癌细胞。

23、(9)根据(7)或(8)所述的方法，位点特异性切口酶是crispr-cas系统。

24、(10)用于在(7)所述的方法中使用的试剂盒，

25、该试剂盒包含对于由染色体a和染色体b构成的同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，在该特定位点的附近dna区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，

26、该位点特异性切口酶的组合对于染色体a，在该特定位点的附近dna区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近dna区域的dna两条链或同一dna链上的单链切割，对于染色体b，在与染色体a中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。

27、发明的效果

28、根据本发明，能够有效地在同源染色体的一方产生特异性的dna缺失。在本发明的方法中，由于进行dna的双链切割，因而不易在包含染色体b在内的基因组全体产生的目的外的突变。另外，由于不使用外来的供者dna，因而也不产生供者dna的随机整合这样的问题。因此，即使将本发明应用于基因治疗等医疗的情况下，安全性也高。另外，根据本发明，以在同源染色体的一方特异性的dna缺失作为指标，能够进行细胞的同源重组功能的评价。