包含垂体组织的细胞群的制备方法及该细胞群与流程

本发明涉及包含垂体组织的细胞群的制备方法及该细胞群。进一步涉及在细胞群中包含神经系统细胞或神经组织、垂体组织以及间充质细胞的细胞团块。垂体为在头部存在的内分泌器官，产生促肾上腺皮质激素(acth)、生长激素等对生物体的维持、生长而言重要的各种垂体激素。在由于垂体的发育不全、垂体功能减退、垂体腺瘤等疾病而产生垂体的功能失调的情况下，产生类似于发育障碍、生殖器相关的异常、肾上腺、甲状腺的异常的严重病情。一般而言，已受到损伤的垂体组织极少自然再生而恢复功能。在专利文献1及非专利文献1、2中报告了通过将人多潜能干细胞在bmp信号转导途径抑制因子乃至作用因子、sonic hedgehog(在本说明书中有时记载为shh)信号转导途径作用因子及tgf-β信号转导途径抑制剂的存在下诱导分化，由此制备了包含垂体细胞的源自头部基板的细胞。然而，制备的细胞是二维培养而成的，达不到重现对功能的发挥而言重要的生物体的复杂垂体组织的结构。本发明人在专利文献2至4和非专利文献3、4中报道了由多潜能干细胞制备立体垂体组织，该组织具有产生垂体激素的能力。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2016-538856号公报专利文献2：wo2013/065763专利文献3：wo2016/013669专利文献4：wo2019/103129非专利文献非专利文献1：dincer et al.cell reports 5，1387-1402，2013.非专利文献2：zimmer et al.stem cell reports 6，858-872，2016.非专利文献3：suga et al.nature.2011 nov 9；480(7375)：57-62.非专利文献4：ozone et al.nature communications 7.10351(2016)：1-10.

背景技术：

技术实现思路

1、发明所要解决的问题

2、本发明的目的是提供一种进一步有效地从多潜能干细胞制备包含垂体组织的细胞群的方法。特别是，提供了一种有效地制备包含适合于人的移植和再生医疗的高质量的垂体组织的细胞群的方法。进而，鉴定并制备相当于适于最终产品的制造、纯化的中间制造体的细胞群。具体而言，就是提供一种可以将无饲养培养的多潜能干细胞作为起始材料，通过降低昂贵重组蛋白的用量，以更便宜的价格生产而有效制备的方法。

3、解决问题的方法

4、本发明人在为解决上述问题进行反复研究时发现：通过在c-jun n末端激酶(jnk)信号转导途径抑制物质的存在下培养，添加bmp信号转导途径作用物质和sonic hedgehog信号转导途径作用物质，由此可以有效地制备包含垂体组织的细胞群。进一步发现，通过同时添加所述jnk信号转导途径抑制物质和wnt信号转导途径抑制物质，可以更有效地制备包含垂体组织的细胞群。

5、即，本发明涉及以下内容。

6、[1]包含垂体组织的细胞群的制备方法，其包括下述步骤(1)及(2)：

7、(1)第一步骤，将多潜能干细胞在c-jun n末端激酶(jnk)信号转导途径抑制物质和wnt信号转导途径抑制物质存在的条件下培养，得到细胞群；

8、(2)第二步骤，将第一步骤得到的细胞群在bmp信号转导途径作用物质和sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。

9、[2]根据[1]所述的制备方法，其特征在于，在第一步骤之前，对多潜能干细胞实施下述步骤(a)：

10、(a)将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)tgfβ家族信号转导途径抑制物质和/或sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养。

11、[2-1]根据[2]所述的制备方法，其中所述步骤(a)中添加的tgfβ家族信号转导途径抑制物质为alk5/tgfβr1抑制剂，alk5/tgfβr1抑制剂包含选自由sb431542、sb505124、sb525334、ly2157299、gw788388、ly364947、sd-208、ew-7197、a83-01、a77-01、repsox、bibf-0775、tp0427736、tgfbr1-in-1、sm-16、tew-7197、ly3200882、ly2109761、krca 0008、gsk 1838705、crizotinib、ceritinib、asp 3026、tae684、azd3463及它们的衍生物组成的组中的至少一种。

12、[3]根据[1]所述的制备方法，第一步骤中的培养进一步是在sonichedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下进行的，在第一步骤及第二步骤中的sonic hedgehog信号转导途径作用物质存在的条件下的培养期间为30天。

13、[4]根据[1]、[2]、[2-1]及[3]的任一项所述的制备方法，对第二步骤得到的细胞群实施下述步骤(3)：

14、(3)第三步骤，将第二步骤得到的细胞群在不存在sonic hedgehog信号转导途径作用物质的条件下培养，得到包含垂体组织的细胞群。

15、[5]根据[4]所述的制备方法，其特征在于，在第三步骤之前，对第二步骤得到的细胞群实施下述步骤(b)；

16、(b)b步骤，将第二步骤得到的细胞群在bmp信号转导途径抑制物质的存在下培养。

17、[5-1]根据[5]所述的制备方法，其中所述步骤(b)中添加的bmp信号转导途径抑制物质包含i型bmp受体抑制剂。

18、[5-2]根据[5-1]所述的制备方法，其中所述i型bmp受体抑制剂包含选自由k02288、dorsomorphin、ldn-193189、ldn-212854、ldn-214117、ml347、dmh1、dmh2、化合物1(compound 1)、vu5350、od52、e6201、saracatinib、byl719及它们的衍生物组成的组中的至少一种。

19、[6]根据[1]～[5]、[2-1]、[5-1]及[5-2]的任一项所述的制备方法，其中所述jnk信号转导途径抑制物质包含jnk抑制剂。

20、[6-1]根据[6]所述的制备方法，其中所述jnk抑制剂包含选自由sp600125、jnk-in-8、db07268、iq-1s、tanzisertib、bentamapimod、bi-78d3、bi-87g3、cc-401、tcs jnk5a、as601245、cv-65、d-jnk1、er-358063、er-409903、er-417258、cc-359、cc-930、sb203580及它们的衍生物组成的组中的至少一种。

21、[6-2]根据[6]或[6-1]所述的制备方法，其中所述jnk抑制剂包含jnk-in-8或sp600125，在包含1nm～50μm的jnk-in-8、或1nm～25μm的sp600125的培养基中开始所述步骤(1)。

22、[7]根据[1]～[5]、[2-1]、[5-1]及[5-2]的任一项所述的制备方法，其中所述jnk信号转导途径抑制物质包含rac抑制剂。

23、[7-1]根据[7]所述的制备方法，其中所述rac抑制剂包含选自由nsc23766、ehop-016、zcl278、mbq-167、krpep-2d、ars-853、salirasib、ml141、eht1864及它们的衍生物组成的组中的至少一种。

24、[8]根据[1]～[7]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、及[7-1]的任一项所述的制备方法，其中所述wnt信号转导途径抑制物质包含对于非经典wnt途径具有抑制活性的物质。

25、[8-1]根据[8]所述的制备方法，具有相对于所述非经典wnt途径的抑制活性物质为porcn抑制剂，porcn抑制剂包含选自由iwp-2、iwp-3、iwp-4、iwp-l6、iwp-12、iwp-o1、lgk-974、wnt-c59、etc-131、etc-159、gnf-1331、gnf-6231、porcn-in-1、rxc004、cgx1321及它们的衍生物组成的组中的至少一种。

26、[9]根据[1]～[8]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]及[8-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在tgf信号转导途径抑制物质。

27、[9-1]根据[1]～[9]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、及[8-1]的任一项所述的制备方法，其中所述a步骤、第一步骤、第二步骤及b步骤的任意一个以上的步骤中添加的sonic hedgehog信号转导途径作用物质包含选自由sag、嘌吗啡胺(purmorphamine)和gsa-10组成的组中的至少一种。

28、[10]根据[1]～[9]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、及[9-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在tak1抑制物质。

29、[10-1]根据[10]所述的制备方法，其中所述tak1抑制物质包含选自由(5z)-7-oxozeaenol、n-des(氨基羰基)az-tak1抑制剂、takinib、ng25、sarsasapogenin及它们的衍生物组成的组中的至少一种。

30、[11]根据[1]～[10]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在fgf信号转导途径作用物质。

31、[11-1]根据[11]所述的制备方法，其中所述fgf信号转导途径作用物质包含选自由fgf2、fgf3、fgf8、fgf10及它们的变体组成的组中的至少一种。

32、[12]根据[1]～[11]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在具有减轻氧化应激作用的物质。

33、[12-1][12]所述的制备方法，其中所述具有减轻氧化应激作用的物质包含选自由抗坏血酸、n-乙酰基-l-半胱氨酸、烟酰胺及它们的衍生物组成的组中的至少一种。

34、[13]根据[1]～[12]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，还存在针对应激反应信号转导途径的抑制物质。

35、[14]根据[1]～[13]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中在所述第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤中，一边摇动一边培养细胞。

36、[15]根据[1]～[14]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中所述第一步骤得到的细胞群为细胞聚集体。

37、[16]根据[1]～[15]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法，其中将所述第一步骤、第二步骤、b步骤以及第三步骤的任意一个以上的步骤，在形成至少1个孔的培养器材中实施，所述孔被分成多个微孔，实施悬浮培养，使得每个所述微孔形成1个细胞团。

38、[17]垂体组织的制备方法，其特征在于，从细胞群回收垂体组织，该细胞群为通过[1]～[16]、[2-1]、[5-1]、[5-2]、[6-1]、[6-2]、[7-1]、[8-1]、[9-1]、[10-1]、[11-1]、及[12-1]的任一项所述的制备方法得到的包含垂体组织的细胞群。

39、发明效果

40、根据本发明，在jnk信号转导途径抑制物质的作用下，向外胚层的诱导分化效率变高，从而能够从多能干细胞中有效地制备包含激素产生能力更高的垂体组织的细胞群。