慢病毒载体、重组干细胞及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种慢病毒载体及含有该慢病毒载体的具有高增殖能力的重组干细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、目前，国内已经有超过30款间充质干细胞药品注册申请临床试验，得到国家药监局(nmpa)默示许可，涉及各种天然组织来源的间充质干细胞(脐带、胎盘、脂肪、牙髓和宫血)和一种胚胎干细胞来源的间充质干细胞。但是天然的间充质干细胞增值传代能力有限，传代次数在10～30代之间，这使得作为产品甚或药品时产品的一致性很难保证，同时也增加了批次检测的频率和成本。临床用的这种细胞代数一般在3～5代，以保证细胞活力。

2、据不完全统计，目前市售的间充质干细胞产品中，单次的治疗费用大都从几万美金起步，甚至十几万美金，没有很好的体现药效经济学。显然，若增加间充质干细胞的增殖能力，增加同一批次的产量，对细胞产品的一致性和质量控制以及降低高昂药价，促成百姓用药具有重要意义。

3、如今，既有ipsc可进行规模化量产，符合药品化的特点，也有天然mscs，天然nk差强人意的临床表现。但是这种途径很难保证ipsc的完全分化和去除，或有残留，安全风险令人堪忧。从天然的mscs入手，在其高安全性的基础上，提高其增值能力的策略或更有潜力。用于研究或医学治疗应用的细胞在体外扩增受到其有限的增殖寿命的限制。间充质干细胞(mscs)由于其再生和免疫抑制特性，已被用于治疗多种免疫相关疾病，在再生医学领域具有巨大的治疗前景。但间充质干细胞由于其有限的增殖能力，无法获取大量的细胞，且受原代细胞获取过程的复杂性和细胞培养过程中的异质性限制，无法大量应用于临床研究。利用ipscs分化获得mscs的策略风险较高。

技术实现思路

1、为了解决间充质干细胞增殖活性低，导致很难成药和成本高昂的问题，本发明提供了一种具有高增殖能力的间充质干细胞，其能够用于治疗与干细胞治疗相关的疾病。

2、为了实现本发明的目的，在第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含载体质粒，所述载体质粒包括含有ψ序列的5’ltr、3’ltr、在5’ltr和3’ltr之间的目的基因序列，以及与所述目的基因序列可操作连接的启动子序列和翻译起始序列，所述目的基因序列为htert的编码核苷酸序列。

3、在一些实施方式中，所述载体质粒的3’ltr和5’ltr包括一个或多个修饰。

4、在一些实施方式中，所述5’ltr和3’ltr的u3可以被缺失或突变。

5、在一些实施方式中，所述3’ltr是缺失了u3区域的3’ltr(3’ltr-δu3)。

6、在一些实施方式中，所述5’ltr是缺失了u3区域的5’ltr(5’ltr-δu3)。

7、在一些实施方式中，所述载体质粒的5’ltr的启动子选自巨细胞病毒cmv启动子、劳斯肉瘤病毒rsv启动子和猿猴病毒sv40启动子，优选选自劳斯肉瘤病毒rsv启动子。

8、在一些实施方式中，与htert的编码核苷酸可操作连接的启动子选自短延伸因子1a(ef1α)启动子或其转录活性片段，rsv启动子和猿猴病毒sv40启动子，优选选自短延伸因子1a(ef1α)启动子。

9、在一些实施方式中，htert的编码核苷酸可操作连接有ef1α启动子和kozak翻译起始序列。

10、在一些实施方式中，所述载体质粒还包括筛选标记物的编码核苷酸。

11、在一些实施方式中，所述筛选标记物选自荧光素酶(luciferase)、荧光蛋白、链霉亲和素结合肽、嘌呤霉素抗性标记物、氨苄抗性标记物、卡那霉素抗性标记物和新霉素抗性标记物中的一种或多种。优选地，所述筛选标记物为荧光素酶。

12、在一些实施方式中，所述荧光素酶的编码核苷酸与htert的编码核苷酸以编码2a肽的核苷酸序列间隔开。所述2a肽可以避免产生融合蛋白。

13、在一些实施方式中，所述2a肽为t2a肽、p2a肽、e2a肽或f2a肽，更优选地，所述2a肽为t2a肽。

14、在一些实施方式中，所述载体质粒还包括sv40早期pa。

15、在一些实施方式中，所述载体质粒的转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。

16、在一些实施方式中，所述载体质粒包含逆转录病毒输出元件。“逆转录病毒输出元件”是指调节rna转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。优选地，所述逆转录病毒输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒(hiv)rev应答元件(rre)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)。

17、在一些实施方式中，所述载体质粒还包括中央多聚嘌呤区(cppt)或中心终止序列(cts)。

18、优选地，所述cppt序列为hiv1的cppt。

19、优选地，所述cts序列为hiv1的cts。

20、在一些实施方式中，所述载体质粒从5’ltr区到3’ltr区依次包含：rsv启动子，5’ltr-δu3，ψ序列，rre，cppt，ef1α启动子，kozak翻译起始序列，由seq id no:1显示的htert的编码核苷酸，t2a，luciferase，wrpe，3’ltr-δu3和sv40早期pa。

21、本发明构建的携带htert编码核苷酸的慢病毒载体在转染重组干细胞后可以过表达htert基因，以抑制增殖过程中端粒缩短，从而延长端粒，达到增强mscs增殖活性的效果。同时，本发明构建的携带htert和luciferase编码核苷酸的慢病毒载体可以和带有荧光基因的病毒联合使用，镜下能够直观观察到转染效率。

22、在第二方面，本发明提供了一种重组干细胞，所述重组干细胞包含第一方面所述的慢病毒载体，能够表达第一方面所述慢病毒载体中携带的目的核苷酸。

23、在一些实施方式中，所述目的核苷酸是由seq id no:1显示的htert的编码核苷酸。

24、在一些实施方式中，所述重组干细胞为间充质干细胞。

25、在一些实施方式中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

26、转染有携带htert编码核苷酸的所述慢病毒载体的重组干细胞特别是间充质干细胞可以过表达htert基因。所述间充质干细胞是具有高增殖能力的间充质干细胞。

27、在第三方面，本发明提供了第二方面的重组干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：

28、(1)构建第一方面的慢病毒载体；

29、(2)用步骤(1)构建的慢病毒载体转染干细胞获得第二方面的重组干细胞；以及

30、(3)培养步骤(2)所获得的重组干细胞。

31、在一些实施方式中，所述细胞为干细胞。

32、在一些实施方式中，所述干细胞为间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

33、在一些实施方式中，所述干细胞为转染有携带htert编码核苷酸的所述慢病毒载体的人脐带间充质干细胞。

34、在一些实施方式中，步骤(2)中，干细胞的接种密度为1.0×105-2.0×105，优选为1.0×105。

35、在一些实施方式中，步骤(2)中，病毒转染复数moi为10-30，优选为15-25。

36、在一些实施方式中，步骤(2)中，转染采用的辅助转染试剂选自聚凝胺(polybrene)。优选地，polybrene的工作浓度为5-8μg/ml。

37、根据本发明的制备方法通过慢病毒的手段，过表达htert基因，以抑制增殖过程中端粒缩短，从而延长端粒，达到增强干细胞特别是间充质干细胞增殖活性的效果。

38、在第四方面，本发明提供了一种细胞药物组合物，所述药物组合物包含第一方面的慢病毒载体或第二方面的重组干细胞，以及药学上可接受的赋形剂或载体。

39、在第五方面，本发明提供了第一方面的慢病毒载体、第二方面的重组干细胞、第三方面的制备方法获得的重组干细胞或第四方面的细胞药物组合物在制备治疗与间充质干细胞治疗相关疾病的药物中的应用。

40、相比于现有技术，本发明具有如下的有益效果：

41、1、本发明的慢病毒载体携带有htert基因和luciferase基因，能够有效检测转染病毒后的细胞在体内的存活率和示踪，有利于后续动物实验的研究。

42、2、本发明构建了一种具有高增殖能力的干细胞，有效延长了细胞的传代能力，延长18代，可以获取大量的批次细胞用于应用，大大提高了获得的干细胞的数量，缩短了由于细胞制备和质控的生产周期，降低了成本，有利于细胞的转换应用。

43、3、在改善细胞增殖活性的同时，维持了细胞多能性标志物的表达，维持其功能。

44、4、本发明获得了一种高增殖活性的间充质干细胞，为未来间充质干细胞产品的转化提供了一种生产高效、质控简化、成本低廉的备选手段。