一种一步式培养液的制作方法

本发明涉及辅助生殖，特别涉及一种一步式培养液。

背景技术：

1、辅助生殖技术是人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology，art)的简称，包括人工授精和体外受精-胚胎移植及其衍生技术两大类。在辅助生殖过程中，每个生殖培养阶段对应的营养需求不同，目前有取卵液培养液、受精液培养液、胚胎培养液等十多种液体，这些培养液中的物质种类烦多且配比复杂。而且由于每次胚胎移植操作仅需要一点培养液体即可进行培养，然而供应商为节省成本提供的培养液多为较大规格的培养液，而培养液有效期很短(3个月～6个月不等)。那么对于每次全过程胚胎培养则需要购买多种大规格的培养液，这些大大增加了胚胎移植过程的成本。

2、在辅助生殖的各阶段培养过程中，细胞会不断与培养液有物质交换，吸收能量及排出细胞因子和代谢废物，对于人类胚胎研究存在伦理制约及目前技术水平限制，尚不能完全清楚胚胎在培养过程中分泌细胞因子的成分及分泌的机理。当频繁的更换培养液不仅会导致胚胎的受损，还会导致某些有益的细胞因子被一并更换，最终降低了胚胎的囊胚率与移植成功率。

3、因此目前胚胎在不同阶段培养，还是需要更换对应的培养液。如公开号为cn103173403a，一种分程胚胎培养液及其制备方法的中国发明专利，在该专利中需要在胚胎早期和后期阶段提供不同的培养液成分，而且操作过程中增加胚胎移植过程中可能收到的机械损伤和培养环境不同造成的应激反应而导致的囊胚形成率不高的问题。

4、如果将整个培养阶段过程中需要的所有营养物质直接混合，这样又会影响培养液的ph值、渗透压和培养效果。目前公开了一些能适用于几个阶段的培养液，如公开号为cn108251354，一步式胚胎培养液及其制备方法的中国发明专利，该一步式胚胎培养液对胚胎培养过程中实质是仍需要取卵液、受精液、一步式胚胎培养液和移植液。由于常规的胚胎培养液并不适用于精子与卵子的受精过程，通常还需要另外配制受精液，ivf成功率及受孕率不高，原因较多，其中一个原因则是ivf使用的培养液对胚胎有或多或少的损伤。由此可见，目前尚没有出现真正意义上能对受精至胚胎阶段进行培养的一步式胚胎培养。

5、因此针对现有技术不足，提供一种一步式培养液以克服现有技术不足尤为必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于避免现有技术不足之处而提供一种一步式培养液，该一步式培养液能够在整个辅助生殖过程对胚胎进行培养。

2、本发明的上述目的通过以下技术措施实现：

3、提供一种一步式培养液，原料含有生理盐、能量物质、能量基质、d-泛酸钙、重组人胰岛素和乙二胺四乙酸。

4、优选的，上述能量基质含有甘氨酸、l-天门冬酰胺一水合物、l-天门冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、丙氨酰谷氨酰胺、l-酪氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-组氨酸盐酸盐一水物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-色氨酸、l-缬氨酸、l-胱氨酸二盐酸盐、l-苏氨酸、l-赖氨酸盐酸盐。

5、优选的，上述能量物质含有d-葡萄糖、l-乳酸钙和丙酮酸钠。

6、本发明的一步式培养液，还含有杀菌剂、ph指示剂和ph缓冲剂。

7、优选的，上述生理盐含有氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁和氯化钙。

8、本发明的一步式培养液，原料的浓度配比为：

9、生理盐：氯化钠88.00mmol/l～105.50mmol/l，氯化钾2.00mmol/l～3.30mmol/l，磷酸二氢钾0.20mmol/l～0.40mmol/l，硫酸镁0.15mmol/l～0.32mmol/l；

10、能量物质：d-葡萄糖0.45mmol/l～0.75mmol/l、l-乳酸钙0.15g/l～0.30g/l、丙酮酸钠0.30mmol/l～0.45mmol/l；

11、能量基质：甘氨酸0.65g/l～0.85g/l、l-天门冬酰胺一水合物1.20g/l～1.65g/l、l-天门冬氨酸1.10g/l～1.50g/l、l-谷氨酸1.20g/l～1.65g/l、l-脯氨酸1.00g/l～1.35g/l、l-丝氨酸0.90g/l～1.20g/l、丙氨酰谷氨酰胺0.80mmol/l～1.20mmol/l、l-酪氨酸1.50g/l～1.98g/l、l-精氨酸盐酸盐5.80g/l～6.80g/l、l-组氨酸盐酸盐一水物1.50g/l～2.50g/l、l-异亮氨酸2.30g/l～2.85g/l、l-亮氨酸2.20g/l～2.95g/l、l-蛋氨酸0.60g/l～0.85g/l、l-苯丙氨酸1.30g/l～1.85g/l、l-色氨酸0.35g/l～0.65g/l、l-缬氨酸2.00g/l～2.60g/l、l-胱氨酸二盐酸盐1.20g/l～1.80g/l、l-苏氨酸2.00g/l～2.80g/l、l-赖氨酸盐酸盐2.00g/l～2.60g/l；

12、d-泛酸钙：5.00μg/l～15.00μg/l；

13、重组人胰岛素：5.00μg/l～50.00μg/l；

14、乙二胺四乙酸：0.005mmol/l～0.020mmol/l；

15、杀菌剂：6.0mg/l～15.0mg/l；

16、ph指示剂：0.0005g/l～0.0200g/l；

17、ph缓冲剂：22.00mmol/l～30.00mmol/l。

18、进一步的本发明的一步式培养液，原料的浓度配比为：

19、生理盐：氯化钠91.20mmol/l～100.70mmol/l，氯化钾2.37mmol/l～3.02mmol/l，磷酸二氢钾0.30mmol/l～0.36mmol/l，硫酸镁0.18mmol/l～0.24mmol/l；

20、能量物质：d-葡萄糖0.51mmol/l～0.68mmol/l、l-乳酸钙0.19g/l～0.24g/l、丙酮酸钠0.35mmol/l～0.41mmol/l；

21、能量基质：甘氨酸0.71g/l～0.79g/l、l-天门冬酰胺一水合物1.43g/l～1.58g/l、l-天门冬氨酸1.26g/l～1.40g/l、l-谷氨酸1.40g/l～1.54g/l、l-脯氨酸1.09g/l～1.21g/l、l-丝氨酸1.00g/l～1.10g/l、丙氨酰谷氨酰胺0.9mmol/l～1.1mmol/l、l-酪氨酸1.71g/l～1.89g/l、l-精氨酸盐酸盐6.00g/l～6.64g/l、l-组氨酸盐酸盐一水物2.00g/l～2.21g/l、l-异亮氨酸2.49g/l～2.76g/l、l-亮氨酸2.49g/l～2.75g/l、l-蛋氨酸0.72g/l～0.79g/l、l-苯丙氨酸1.57g/l～1.73g/l、l-色氨酸0.48g/l～0.54g/l、l-缬氨酸2.22g/l～2.46g/l、l-胱氨酸二盐酸盐1.49g/l～1.64g/l、l-苏氨酸2.26g/l～2.50g/l、l-赖氨酸盐酸盐2.22g/l～2.46g/l；

22、d-泛酸钙：8.00μg/l～12.00μg/l；

23、重组人胰岛素：10.00μg/l～25.00μg/l；

24、乙二胺四乙酸：0.012mmol/l～0.014mmol/l；

25、杀菌剂：9.50mg/l～10.50mg/l；

26、ph指示剂：0.0010g/l～0.0100g/l；

27、ph缓冲剂：26.30mmol/l～28.25mmol/l。

28、本发明的一步式培养液，还含有人血清白蛋白。

29、以浓度配比计，人血清白蛋白0.01ml/l～15.00ml/l。

30、进一步以浓度配比计，人血清白蛋白0.5ml/l～

31、10.20ml/l。

32、优选的，上述杀菌剂为硫酸庆大霉素。

33、优选的，上述ph指示剂为苯酚红钠盐。

34、本发明的一种一步式培养液，原料含有生理盐、能量物质、能量基质、d-泛酸钙、重组人胰岛素和乙二胺四乙酸。所述能量基质含有甘氨酸、l-天门冬酰胺一水合物、l-天门冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、丙氨酰谷氨酰胺、l-酪氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-组氨酸盐酸盐一水物、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-色氨酸、l-缬氨酸、l-胱氨酸二盐酸盐、l-苏氨酸、l-赖氨酸盐酸盐；所述能量物质含有d-葡萄糖、l-乳酸钙和丙酮酸钠。所述生理盐含有氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁和氯化钙。本发明的一步式培养液能够清除在培养过程中细胞分泌的有害的细胞因子和代谢废物，对培养有利细胞因子则能够保留在一步式培养液中，同时该一步式培养液可以有效减少人工操作，减少机械损伤以及应激反应，故该一步式培养液具有较高的囊胚率及移植成功率。本发明的一步式培养液可以在整个辅助生殖过程对胚胎进行培养，相当于现有技术中的取卵液、受精液、早期阶段胚胎培养液和后期阶段胚胎培养液，或者是取卵液、受精液和传统的一步式胚胎培养液，因此能减少培养液的种类也可缩减体外受精-胚胎移植的成本。