人小脑蛋白配体和包含其的双官能化合物的制作方法

本说明书提供了基于酰亚胺的化合物，包括包含其的双官能化合物，以及相关使用方法。双官能化合物可用作靶向泛素化的调节剂，尤其是关于多种多肽和其他蛋白质，它们被根据本公开的双官能化合物降解和/或以其他方式抑制。

背景技术：

1、大多数小分子药物在紧密和明确界定的口袋中结合酶或受体。另一方面，由于其大接触表面以及所牵涉的浅沟或平坦界面，蛋白质-蛋白质相互作用众所周知难以使用小分子靶向。e3泛素连接酶(其中数百种在人中已知)赋予关于泛素化的底物特异性，并且因此，由于其对于某些蛋白质底物的特异性，是比一般蛋白酶体抑制剂更有吸引力的治疗靶。e3连接酶配体的开发已证明是挑战性的，部分是由于它们必须破坏蛋白质-蛋白质相互作用的事实。然而，最近的发展已提供了与这些连接酶结合的特异性配体。例如，自从发现第一个小分子e3连接酶抑制剂nutlin以来，已报道了靶向e3连接酶的另外化合物，但该领域仍是发展不完全的。

2、一种具有治疗潜力的e3连接酶是希佩尔-林道(hippel-lindau,vhl)肿瘤抑制因子。vhl包含底物识别亚基/e3连接酶复合物vcb(其包含延伸蛋白b和c)以及包含cullin-2和rbx1的复合物。vhl的主要底物是缺氧诱导因子1α(hif-1α)，其是响应低氧水平上调基因例如促血管生成生长因子vegf和红血细胞诱导细胞因子促红细胞生成素的转录因子。我们生成了针对e3连接酶的底物识别亚基的希佩尔-林道蛋白(vhl)的第一个小分子配体vcb(癌症、慢性贫血和局部缺血中的重要靶标)，并且获得晶体结构，证实该化合物模拟转录因子hif-1α(vhl的主要底物)的结合模式。

3、人小脑蛋白(cereblon)是人中由crbn基因编码的蛋白质。crbn直向同源物从植物到人都是高度保守的，这强调了它的生理重要性。人小脑蛋白与受损的dna结合蛋白1(ddb1)、cullin-4a(cul4a)和cullin调节剂1(roc1)形成e3泛素连接酶复合物。这种复合物使许多其他蛋白质泛素化。通过尚未完全阐明的机制，靶蛋白的人小脑蛋白泛素化导致成纤维细胞生长因子8(fgf8)和成纤维细胞生长因子10(fgf10)的水平增加。fgf8依次又调节许多发育过程，例如肢体和听泡形成。净结果是这种泛素连接酶复合物对于胚胎中的肢体生长是重要的。在不存在人小脑蛋白的情况下，ddb1与ddb2形成复合物，所述ddb2充当dna损伤结合蛋白。

4、已被批准用于治疗多种免疫适应症的沙立度胺也已被批准用于治疗某些赘生疾病，包括多发性骨髓瘤。除多发性骨髓瘤之外，沙立度胺和其若干类似物当前还处于用于治疗多种其他类型癌症的研究中。虽然沙立度胺抗肿瘤活性的确切机理仍在探明，但已知其抑制血管生成。最近讨论酰亚胺生物学的文献包括lu等人，science 343,305(2014)和等人，science 343,301(2014)。

5、重要的是，已知沙立度胺和其类似物(例如泼莫灵胺(pomolinamiode)和来纳灵胺(lenalinomide))结合人小脑蛋白。这些药剂结合到人小脑蛋白，从而改变复合物诱导ikaros(ikzf1)和aiolos(ikzf3)(多发性骨髓瘤生长所必需的转录因子)泛素化和降解的特异性。事实上，人小脑蛋白的表达较高与酰亚胺药物治疗多发性骨髓瘤的功效提高有关。

6、brd4因其作为多种疾病、尤其是癌症的新型靶标的巨大潜力而受到学术界和制药业的广泛关注。brd4属于溴结构域和额外末端结构域(bet)家族，其特征在于n末端的两个溴结构域(bd结构域)和c末端的额外末端结构域(et结构域)(j.shi等人，molecular cell,54(2014)728-736和a.c.belkina等人，nat.rev.cancer,12(2012)465-477)。两个bd结构域识别并与组蛋白n末端尾部的乙酰化赖氨酸残基相互作用；et结构域尚未完全表征，并且在很大程度上被认为在募集多种转录调节因子时起到支架功能的作用。因此，brd4通过将相关转录调节剂募集到特定基因组位点而在调节基因表达中发挥关键作用。一些研究已确定brd4优先定位于超级增强子区域，这些区域通常位于重要致癌基因(例如c-myc、bcl-xl和bcl-6)的上游，并且在调节它们的表达方面起关键作用(j.loven等人，cell,153(2013)320-334和b.chapuy等人，cancer cell,24(2013)777-790)。由于其在调节重要致癌基因表达中的关键作用，brd4在多种癌症类型(包括中线癌、aml、mm、bl和前列腺癌)中成为有前景的治疗靶标(j.loven等人，cell,153(2013)320-334；j.zuber等人，nature,478(2011)524-528；j.e.delmore等人，cell,146(2011)904-917；j.a.mertz等人，pnas,108(2011)16669-16674；a.wyce等人，oncotarget,4(2013)2419-2429；i.a.asangani等人，nature,510(2014)278-282；以及c.a.french等人，oncogene,27(2008)2237-2242)。brd4在特定致癌基因附近的基因组位点的独特高占据率提供了潜在的治疗窗口，该治疗窗口允许特异性靶向肿瘤细胞，同时保留正常组织。具体地讲，brd4可作为靶向c-myc的替代策略，其有助于大多数人类癌症的发展和维持，但仍然是无成药性的(j.e.delmore等人，cell,146(2011)904-917；j.a.mertz等人，pnas,108(2011)16669-16674；m.g.baratta等人，pnas,112(2015)232-237；以及m.gabay等人，cold spring harb perspect med.(2014)4:a014241)。

7、小分子brd4抑制剂如jq1、ibet和otx15的开发已在各种癌症(包括bl)的临床前模型中被证实具有有前景的治疗潜力(j.loven等人，cell,153(2013)320-334；b.chapuy等人，cancer cell,24(2013)777-790；j.e.delmore等人，cell,146(2011)904-917；j.a.mertz等人，pnas,108(2011)16669-16674；i.a.asangani等人，nature,510(2014)278-282；m.g.baratta等人，pnas,112(2015)232-237；m.boi等人，clin.cancer res.,(2015)21(7):1628-38；以及a.puissant等人，cancer discovery,3(2013)308-323)。实际上，brd4抑制剂在不同的小鼠肿瘤模型中显示出具有良好耐受性的各种抗肿瘤活性，并且不足为奇的是，对brd4抑制剂如jq1的高度敏感性与不同肿瘤类型(包括c-myc驱动的bl)中高水平的c-myc和n-myc相关。几乎所有bl病例都含有c-myc基因易位，使其处于位于igh上游的超级增强子的控制下，从而驱动异常高水平的c-myc表达、肿瘤发展和维持(k.klapproth等人，british journal of haematology,149(2010)484-497)。

8、目前，四种bet溴结构域抑制剂处于i期临床试验中，主要集中于中线癌和血液恶性肿瘤(cpi-0610、nct01949883；gsk525762、nct01587703；otx015、nct01713582；ten-010、nct01987362)。使用brd4抑制剂的临床前研究证实了其在抑制bl细胞系中c-myc和增殖方面的价值，但ic50值通常在100nm至1um的范围内(j.a.mertz等人，pnas,108(2011)16669-16674和m.ceribelli等人，pnas,111(2014)11365-11370)。因此，尽管brd4抑制剂快速进展，brd4抑制的作用令人备受鼓舞，但不太理想，因为该作用主要是抑制细胞生长的并且需要相对高浓度的抑制剂。

9、本领域持续需要有效治疗疾病，尤其是增生和癌症，例如多发性骨髓瘤。然而，非特异性作用以及完全没有能力靶向和调节某些类别的蛋白质(例如转录因子)仍然是开发有效抗癌剂的障碍。因此，非常适用作治疗剂的将是利用或增强人小脑蛋白底物特异性并且同时“能调节”的小分子治疗剂，以便能够靶向各种各样的蛋白质并且调节其而具有特异性。

技术实现思路

1、本公开描述了双官能化合物及其使用方法，所述双官能化合物用于将内源蛋白质募集到e3泛素连接酶上以进行降解。确切地说，本公开提供了双官能或蛋白分解靶向嵌合(protac)化合物，其适用作多种多肽和其他蛋白质的靶向泛素化调节剂，所述多肽和其他蛋白质在靶向泛素化之后被如本文所述的双官能化合物降解和/或以其他方式抑制。本文所提供化合物的优势在于，与来自几乎任何蛋白质类别或家族的靶向多肽的降解/抑制一致，可以存在广谱药理学活性。此外，本说明书提供了使用有效量的如本文所述化合物治疗或改善疾病病状如癌症(例如，多发性骨髓瘤)的方法。

2、因此，在一个方面，本公开提供了如本文所述的基于酰亚胺的新型化合物。

3、在另一方面，本公开提供了双官能或protac化合物，该化合物包含e3泛素连接酶结合部分(即，e3泛素连接酶的配体或“ulm”基团)和靶蛋白结合部分(即，蛋白质/多肽靶向配体或“ptm”基团)，使得靶蛋白/多肽被置于泛素连接酶附近以实现该蛋白的降解(和抑制)。在一个优选的实施方案中，ulm是人小脑蛋白e3泛素连接酶结合部分(即，“clm”)。例如，双官能化合物的结构可以描绘为：

4、

5、如本文中所图示的ptm和clm部分的相应位置以及其数目仅为了举例而提供，并非旨在以任何方式限制所述化合物。如本领域技术人员所理解的，可以合成如本文所述的双官能化合物，使得各个官能部分的数目和位置可以根据需要而变。

6、在某些实施方案中，双官能化合物还包含化学接头(“l”)。在该实例中，双官能化合物的结构可以描绘为：

7、

8、其中ptm是蛋白质/多肽靶向部分，l是接头，并且clm是人小脑蛋白e3泛素连接酶结合部分。

9、在某些优选的实施方案中，e3泛素连接酶是人小脑蛋白。因此，在某些其他实施方案中，双官能化合物的clm包含化学部分，例如酰亚胺、酰胺、硫代酰胺、硫代酰亚胺衍生部分。在其他实施方案中，clm包含邻苯二酰亚胺基团或其类似物或衍生物。在另外的实施方案中，clm包含邻苯二酰亚胺-戊二酰亚胺基团或其类似物或衍生物。在另外的实施方案中，clm包含由沙立度胺、来那度胺、泊马度胺和其类似物或衍生物组成的组的成员。

10、在某些实施方案中，如本文所述的化合物包含多个clm、多个ptm、多个化学接头或它们的组合。

11、在本文所述的任何方面或实施方案中，ulm(泛素化连接酶调节剂)可以是希佩尔-林道e3泛素连接酶(vhl)结合部分(vlm)，或人小脑蛋白e3泛素连接酶结合部分(clm)，或小鼠双微体2同源物(mdm2)e3泛素连接酶结合部分(mlm)，或iap e3泛素连接酶结合部分(即“ilm”)。在本文所述的任何方面或实施方案中，双官能化合物包含至少一个另外的e3连接酶结合部分，其选自vlm、vlm’、clm、clm’、mlm、mlm’、ilm、ilm’或它们的组合。例如，可存在至少1个、2个、3个、4个或5个另外的e3连接酶结合部分。

12、在另一方面，本说明书提供了治疗组合物，其包含有效量的如本文所述化合物或其盐形式和药学上可接受的载体。治疗组合物调节患者或受试者(例如动物，例如人)中的蛋白质降解，并且可以用于治疗或改善通过降解的蛋白质调节的疾病状态或状况。在某些实施方案中，如本文所述的治疗组合物可用于实现所关注蛋白质的降解，以治疗或改善疾病，例如癌症。在又一方面，本公开提供了泛素化/降解细胞中的靶蛋白的方法。在某些实施方案中，该方法包括施用如本文所述的双官能化合物，该双官能化合物包含优选通过如本文另外所述的接头部分连接的clm和ptm，其中clm与ptm偶联且其中clm识别泛素路径蛋白质(例如，泛素连接酶，优选e3泛素连接酶，如人小脑蛋白)并且ptm识别靶蛋白，使得当靶蛋白被置于泛素连接酶附近时，将发生靶蛋白的降解，从而实现靶蛋白的降解/靶蛋白效应的抑制及蛋白质水平的控制。通过本公开提供的蛋白质水平的控制提供了疾病状态或状况的治疗，其通过降低患者细胞中该蛋白质的水平而通过靶蛋白调节。

13、在另一方面，本说明书提供了一种用于评估(即，测定和/或测量)clm结合亲和力的方法。在某些实施方案中，该方法包括提供目的测试剂或化合物，例如具有酰亚胺部分的药剂或化合物，例如邻苯二酰亚胺基团、邻苯二酰亚胺-戊二酰亚胺基团、衍生化沙立度胺、衍生化来那度胺或衍生化泊马度胺，以及对测试剂或测试化合物的人小脑蛋白结合亲和力和/或抑制活性与已知结合和/或抑制人小脑蛋白活性的药剂或化合物进行比较。

14、在另一方面，本说明书提供了用于治疗或改善受试者或患者(例如动物，例如人类)的疾病、病症或其症状的方法，该方法包括向有需要的受试者施用组合物，该组合物包含有效量(例如治疗有效量)的本文所述化合物或其盐形式，和药学上可接受的载体，其中所述组合物能够有效治疗或改善受试者的疾病或病症或其症状。

15、在另一方面，本说明书提供了使用根据本公开的化合物鉴别生物系统中的所关注蛋白质降解的影响的方法。

16、前述一般实用领域仅为了举例而给出，并且不希望对本公开的范围和所附权利要求书构成限制。根据本权利要求、说明书和实例，本领域普通技术人员将了解与本公开的组合物、方法和方法相关的另外目的和优点。例如，本发明的各个方面和实施方案可以众多组合利用，所有这些组合都由本说明书明确地加以考虑。这些额外的优势目标和实施方案明确地包含在本公开的范围内。本文用于阐明本发明的背景并且在特定情况下提供关于实践的另外细节的出版物和其他材料以引用方式并入。