一种原代细胞专用慢病毒感染试剂盒及其使用方法与应用与流程

本发明属于慢病毒病毒感染原代细胞培养，尤其涉及一种原代细胞专用慢病毒感染试剂盒及其使用方法与应用。

背景技术：

1、慢病毒是逆转录病毒的一种，在基因工程领域内，慢病毒载体作为一种常见的载体，能够将外源基因整合到宿主细胞并稳定表达。目前的慢病毒载体都是以hiv-1为基础发展起来的，具备感染分裂和非分裂细胞的能力。常用的第二代慢病毒载体系统也叫三质粒系统，包含2个辅助质粒pspax2、pmd2g和1个目的质粒，将三个质粒共同转染到293t工具细胞中，得到的慢病毒颗粒会分泌到细胞上清中，通过浓缩和纯化处理最终得到的慢病毒液可以用于细胞实验。

2、原代细胞是指从组织中直接分离出来并培养的细胞。大部分原代细胞在10代以内可以维持本身的细胞特性和良好细胞状态，10代以后的细胞可能会分化、衰老或死亡。在细胞实验中，使用原代细胞作为实验材料比细胞系能够更加真实地反映细胞功能。大部分细胞系传代周期短，传代次数多，细胞状态稳定，容易进行改造，在导入外源基因时可以选择多种方式，如细胞转染、病毒感染等。相比于细胞系，常规的脂质体转染法很难将目的基因转入到原代细胞中，更多的会选择用慢病毒感染法来导入外源基因。但是由于原代细胞传代次数有限或不能传代，不同的原代细胞感染效率也不同，因此提高慢病毒感染效率对原代细胞感染实验来说是非常关键的。

3、目前市场上还没有慢病毒感染试剂盒，感染原代细胞与普通肿瘤细胞的试剂和流程相同，慢病毒感染过程中用到的培养基就是目的细胞原本生长所使用的完全培养基，该完全培养基中通常会加入10％的胎牛血清和终浓度为100u/ml的青-链霉素。感染实验时在培养基中加入合适moi的慢病毒，常用助感染试剂为polybrene，但是，polybrene对细胞有一定毒性，因此，在原代细胞中不常使用。

4、然而，对于慢病毒感染原代细胞的常规培养基中，其存在的缺陷如：第一，在病毒感染操作中使用的10％含量的胎牛血清，对于增殖较快的原代细胞，感染效率会降低；第二，培养基中使用青-链霉素仅能预防细菌的污染，对于目前常见的支原体污染来说没有作用；第三，对于生长较为敏感的原代细胞，常用的慢病毒促感染试剂polybrene，会直接影响到细胞状态，在感染过后可能会致死细胞。因此，研发一种原代细胞专用的慢病毒感染试剂盒，成为本领域技术人员的研发重点。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其在慢病毒感染原料细胞的过程中使用时，能够显著提高原代细胞感染效率，增加原代细胞感染的成功率，且不影响细胞状态和特性，使感染后的细胞状态更好，并降低了细胞受到污染的概率。

2、为了实现本发明的目的，本发明提供了一种原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，包括a、b、c三种组分，所述a组分为原代细胞转染操作中使用的培养基，所述b组分为a组分的添加物，所述c组分为转染促进剂；

3、所述a组分中含有基础培养基和胎牛血清；

4、所述b组分中含有支原体抑制剂和青-链霉素；

5、所述c组分中含有pluronic f-127。

6、进一步的，所述a组分中含有体积浓度为95％的dmem/f12基础培养基和5％的胎牛血清。

7、进一步的，所述b组分中含有浓度为250μg/ml支原体抑制剂和5000u/ml青-链霉素。

8、进一步的，所述c组分中pluronic f-127的浓度为50～200mg/ml。

9、进一步的，所述dmem/f12基础培养基为体积比为1：1的dmem培养基和ham'sf-12培养基。

10、进一步的，所述b组分的配置方法为：将支原体抑制剂、青-链霉素和pbs混合均匀，-20℃保存即可。

11、进一步的，所述c组分中pluronic f-127的配置方法为：称取适量pluronic f-127粉末，溶于dmso中，置于50℃水浴中加热，完全溶解后，常温保存即可。

12、本发明还提供了一种原代细胞专用慢病毒感染试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：

13、(1)先将b组分稀释50倍，然后将a组分、稀释后的b组分和c组分混合成工作液，待使用；

14、(2)将培养后的原代细胞取出置于工作液中，然后加入目的病毒感染24～48h，荧光显微镜下观察原代细胞的荧光覆盖率在80％以上时，将工作液更换为基础培养基，继续培养病毒感染后的原代细胞。

15、进一步的，所述工作液中a组分与稀释后b组分的体积比为49：1；所述组分c在工作液中的浓度为5～100μg/ml。

16、本发明提供的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒可应用于小鼠胚胎干细胞的慢病毒感染实验和人真皮成纤维细胞的慢病毒感染实验中。

17、本发明取得了以下有益效果：

18、1、相比于其它基础培养基，本发明的a组分选用dmem培养基和ham'sf–12培养基的混合物为基础培养基更适用于原代细胞的培养，并且，dmem/f12基础培养基作为开发无血清培养基的基础，也适用于低血清含量下动物细胞的培养。

19、2、本发明a组分中的胎牛血清浓度是5％，而正常细胞培养用到的胎牛血清的浓度是10％，本发明的试剂盒选用低浓度的胎牛血清培养基能够降低细胞的增殖速度，让细胞更容易感染，提高了原代细胞的病毒感染效率。

20、3、本发明的b组分选用青-链霉素和支原体抑制剂混合液来作为细胞的添加因子，能够更有效的防止细胞污染。通常细胞培养只会用到青-链霉素来预防细菌污染，但是现在支原体污染越来越普遍，原代细胞对支原体更加敏感，因此，本发明试剂盒中加入支原体抑制剂能够增加原代细胞感染的成功率。

21、4、本发明的c组分采用pluronic f-127，相比于目前市面上常用的polybrene，不仅促感染效果更好，且对原代细胞没有伤害。

22、5、本发明中b组分和c组分，若浓度过高会致死细胞，若浓度过低则没有效果；a组分和b组分进行组合，是维持细胞生长的一个基础环境，c组分则是在慢病毒感染细胞的操作过程中，促进感染效果的一个试剂。

23、6、本发明的试剂盒做原代细胞的慢病毒感染，其感染效率更高，感染后细胞状态更好，细胞受到污染的概率。

技术特征：

1.一种原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其特征在于，包括a、b、c三种组分，所述a组分为原代细胞转染操作中使用的培养基，所述b组分为a组分的添加物，所述c组分为转染促进剂；

2.根据权利要求1所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其特征在于，所述a组分中含有体积浓度为95％的dmem/f12基础培养基和5％的胎牛血清。

3.根据权利要求1所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其特征在于，所述b组分中含有浓度为250μg/ml支原体抑制剂和5000u/ml青-链霉素。

4.根据权利要求1所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其特征在于，所述c组分中pluronic f-127的浓度为50～200mg/ml。

5.根据权利要求2所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其特征在于，所述dmem/f12基础培养基为体积比为1：1的dmem培养基和ham'sf-12培养基。

6.根据权利要求3所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其特征在于，所述b组分的配置方法为：将支原体抑制剂、青-链霉素和pbs混合均匀，-20℃保存即可。

7.根据权利要求4所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其特征在于，所述c组分中pluronic f-127的配置方法为：称取适量pluronic f-127粉末，溶于dmso中，置于50℃水浴中加热，完全溶解后，常温保存即可。

8.如权利要求1-7任一项所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒的使用方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒的使用方法，其特征在于，所述工作液中a组分与稀释后b组分的体积比为49：1；所述组分c在工作液中的浓度为5～100μg/ml。

10.一种如权利要求1-7任一项所述的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒在小鼠胚胎干细胞的慢病毒感染实验和人真皮成纤维细胞的慢病毒感染实验中的应用。

技术总结
本发明公开一种原代细胞专用慢病毒感染试剂盒及其使用方法与应用，涉及慢病毒病毒感染原代细胞培养技术领域。本发明公开的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，包括A、B、C三种组分，所述A组分中含有95％DMEM/F12基础培养基和5％胎牛血清；所述B组分中含有250μg/ml支原体抑制剂和5000U/ml青‑链霉素；所述C组分中含有50～200mg/ml Pluronic F‑127。本发明提供的原代细胞专用慢病毒感染试剂盒，其在慢病毒感染原料细胞的过程中使用时，能够显著提高原代细胞感染效率，增加原代细胞感染的成功率，且不影响细胞状态和特性，使感染后的细胞状态更好，并降低了细胞受到污染的概率。

技术研发人员：胡清云
受保护的技术使用者：湖南丰晖生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13