一种CD45基因分型检测的引物组合及检测试剂盒和应用

本发明属于基因分型检测，具体涉及一种cd45基因分型检测的引物组合及检测试剂盒和应用。

背景技术：

1、跨膜受体酪氨酸磷酸酶蛋白cd45(ly5，ptprc)是一种在所有有核造血细胞上表达的蛋白，是调控环境信号整合到细胞反应中的关键控制蛋白。对cd45突变细胞系、cd45缺陷小鼠和cd45缺陷人类的研究，初步证实了cd45在抗原受体、细胞因子受体信号转导和淋巴细胞发育中的重要作用。

2、有研究报道在sjl小鼠中鉴定出ptprc位点(编码cd45，也称为ly5)的遗传变异，即ptprca等位基因(编码cd45.1)。cd45常见的形式是cd45.2，在c57bl/6小鼠表达；而sjl小鼠则表达cd45.2。cd45.1和cd45.2等位基因在细胞外结构域只存在5个氨基酸的差异，并且这种编码变异不影响其功能，但其独特的表位变化可以通过单克隆抗体进行特异性识别。为了使用cd45的突变作为实验工具，研究人员将sjl小鼠的ptprca等位基因反交至c57bl/6小鼠，以产生b6.sjl-ptprcapepcb小鼠(即b6.sjl-cd45.1小鼠)。b6.sjl-cd45.1小鼠广泛应用于竞争性移植模型、混合骨髓嵌合体实验等免疫研究中，通过使用cd45.2或cd45.1特异性的单克隆抗体可以示踪移植的细胞。

3、鉴定cd45.1是b6.sjl-cd45.1小鼠应用的重要环节。近年来已发展出单克隆抗体、荧光探针，sanger测序等方法。其中，sanger测序法的优点是准确度高，但存在设备要求高、耗时长、成本高等缺点，多数实验室不具备自行检测的条件。单克隆抗体法常使用小鼠眼眶取血，采样困难、要求相对较多的活细胞才能用于后续检测，且样本前处理步骤繁琐、需要流式检测、成本昂贵、准确度不高，重复性差。荧光探针法同样存在样本前处理步骤繁琐、成本昂贵、特异性不强、耗时长等缺点。

4、因此，开发一种新型简单、高效、准确、经济的cd45.1鉴定方法对b6.sjl-cd45.1小鼠的广泛应用具有重大意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种cd45基因分型检测的引物组合及检测试剂盒和应用。本发明提供了一种经济、简单、高效、准确的b6.sjl-cd45.1小鼠(以下简称cd45.1小鼠)鉴定手段，通过截取小鼠少量组织提取小鼠dna，取dna样品用特异性引物进行pcr扩增，最后将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统拍照即可得到鉴定结果。所述方法操作简便，成本低廉，结果准确且耗时极短，可极大地降低b6.sjl-cd45.1小鼠的鉴定难度，在保证其鉴定结果准确性的同时，节约成本以及人力物力。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种cd45基因分型检测的引物组合，所述引物组合包括检测cd45.1的引物和阳性对照引物；

4、所述检测cd45.1的引物包括seq id no:3和seq id no:6所示的核苷酸序列。

5、本发明中，所述检测cd45.1的引物可扩增cd45.1序列，而无法扩增cd45.2序列，所述阳性对照引物对cd45.1和cd45.2序列均可有效扩增，用于判定pcr扩增反应及实验流程是否成功。

6、优选地，所述阳性对照引物包括seq id no:1和seq id no:6所示的核苷酸序列。

7、f3：seq id no:3：ctgcatctaaacctgatc；

8、r：seq id no:6：cttctccatgagatgcgtgttc；

9、f1：seq id no:1：tagtctcttggcctgagcctgc；

10、r：seq id no:6：cttctccatgagatgcgtgttc。

11、本发明中，f1+r引物在同样的pcr条件下，既可以扩增突变型cd45.1小鼠的dna，又可以扩增出与f1引物3’端不匹配的野生型cd45.2小鼠的dna，不具有任何特异性。因此，将f1+r引物设置为试剂盒中的阳性对照引物，用于判定pcr扩增反应及实验流程是否成功。

12、本发明中，合成了与cd45.1匹配较高，但与cd45.2具有更多碱基错配的引物f3，f3+r引物可以在退火温度62-64℃的情况下有效识别cd45.1小鼠的dna，而cd45.2小鼠的dna则无法扩增，因此，以f3+r引物作为检测cd45.1的引物。

13、第二方面，本发明提供一种cd45基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒中含有第一方面所述的cd45基因分型检测的引物组合。

14、优选地，所述试剂盒中还含有dna快速提取试剂和/或保真扩增酶体系。

15、优选地，所述dna快速提取试剂中包含消化液和中止液。

16、优选地，所述消化液为30-100mm的naoh溶液，例如可以是30mm、50mm、80mm或100mm等。

17、优选地，所述中止液为0.5-2m的tris-hcl溶液，例如可以是0.5m、0.6m、1.0m或2.0m等，ph为6-7.5，例如可以是6、6.5、7、7.3或7.5等。

18、优选地，所述保真扩增酶体系为：primestar max dna polymerase体系。

19、第三方面，本发明提供一种cd45基因分型检测方法，所述检测方法包括：

20、(1)采用第二方面所述的cd45基因分型检测的试剂盒提取小鼠dna；

21、(2)基于提取的小鼠dna，利用第一方面所述的cd45基因分型检测的引物组合进行pcr扩增；

22、(3)将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断cd45基因的基因型。

23、优选地，步骤(2)中，所述pcr扩增实验中的扩增体系按终浓度计包括：检测cd45.1的引物或阳性对照引物0.5-2μm(例如可以是0.5μm、0.8μm、1μm、1.2μm、1.5μm、1.8μm或2μm等)，1×primestar max dna polymerase。

24、优选地，步骤(2)中，所述pcr扩增实验中的扩增程序为：

25、预变性：95-98℃，20-40s；变性：95-98℃，8-15s；退火：62-64℃，8-15s；延伸：70-72℃，10-30s；变性-延伸：32-35个循环；补充延伸：70-72℃，2-5min。

26、本发明所述扩增程序中，预变性：95-98℃，20-40s；预变性的温度例如可以是95℃、96℃、97℃或98℃等，预变性的时间例如可以是20s、30s或40s等；

27、变性：95-98℃，8-15s；变性的温度例如可以是95℃、96℃、97℃或98℃等，变性的时间例如可以是8s、10s或15s等；

28、退火：62-64℃，8-15s；退火的温度例如可以是62℃、63℃或64℃等，退火的时间例如可以是8s、10s或15s等；

29、延伸：70-72℃，10-30s；延伸的温度例如可以是70℃、71℃或72℃等，延伸的时间例如可以是10s、20s或30s等；

30、变性-延伸：32-35个循环(例如可以是32、33、34或35)，补充延伸：70-72℃，2-5min，补充延伸的温度例如可以是70℃、71℃或72℃等，补充延伸的时间例如可以是2min、3min或5min等。

31、优选地，步骤(3)中，所述判断cd45基因的基因型的标准包括：

32、在阳性对照引物成功扩增出产物前提下；若检测cd45.1的引物成功扩增出pcr产物，则样品为cd45.1突变型基因型；若检测cd45.1的引物无法扩增出pcr产物，则样品为cd45.2野生型基因型。

33、第四方面，本发明提供第一方面所述的cd45基因分型检测的引物组合、第二方面所述的cd45基因分型检测的试剂盒或第三方面所述的cd45基因分型检测方法中任意一种或至少两种的组合在cd45基因分型检测中的应用。

34、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

35、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

36、(1)提升检测速度、降低操作难度。应用本发明所提供的试剂盒，将鉴定cd45.1突变的时间降低至1.5小时，且操作简单，无复杂精密的操作，极大地节约了时间和人力成本。

37、(2)降低检测成本、减少对贵重仪器的依赖。应用本发明所提供的试剂盒，单次样本检测成本低至1.78元，且无需依赖贵重仪器，仅需普通pcr仪即可完成检测，所需成本大幅降低，常规实验室均能自行完成cd45.1突变小鼠的基因型鉴定。

38、(3)提高检测灵敏度。应用本发明所提供的试剂盒，检测限可低至0.0001ng/μl，仅需微量dna即可鉴定，提高了检测灵敏度，克服了现有鉴定技术对样本收集要求高的困难。