金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体、制备方法及其应用

本发明属于食品检测，涉及α-溶血素免疫学检测，具体涉及一种金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体、制备方法及其应用。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌，可引起人类和动物的多种感染和疾病，包括皮肤感染、肺炎、心肌内膜炎、中毒性休克综合症和败血症等。金黄色葡萄球菌可表达多种毒素来破环宿主的稳态，包括肠毒素、溶血素、毒性休克综合征毒素1、杀白细胞素等，其中溶血素作为金黄色葡萄球菌的外毒素是造成金黄色葡萄球菌感染最重要的致病因子，能损伤红细胞、血小板，破坏溶酶体引起局部缺血和坏死。溶血素根据其抗原的差异，可以分为α、β、γ、δ、ε5种类型，根据研究所知，其中α溶血素是公认的致病作用最强的一种，也是目前研究最广泛、机制最为明确和清楚的一种溶血素。

2、α-溶血素是一种小的β-桶状成孔毒素，对许多哺乳动物细胞具有毒性，以水溶性单体(33.2kda)的形式分泌，在宿主细胞膜上组装形成跨膜寡聚七聚体(232.4kda)通道，可以允许分子量小于2kda的分子通过，如钾离子、钠离子，从而引起宿主细胞裂解或死亡。有研究表明hla是金黄色葡萄球菌用来逃避宿主免疫系统或抗生素的主要毒力因子，因此，对组织样品及食品样品中α-溶血素的检测尤为重要。

3、酶联免疫吸附分析方法是1971年由engvall和perlmann在《酶联免疫吸附试验用于igg定量测定》中提出的全新免疫分析方法。它是利用抗原抗体在固相载体表面结合后，加入标记酶(以辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶为主)形成依旧有活性的结合物，接着催化底物产生显色反应，且显示的颜色深浅与相应抗原抗体有线性关系，从而实现对样品检测的分析方法。该方法不仅具有抗原-抗体的特异性，同时还保留了酶联放大反应的高灵敏度，因此成为了一种基本的免疫方法而被将广泛应用。

4、目前，国内外研究制备的金黄色葡萄球菌α-溶血素抗体均为识别其表面抗原的多克隆抗体或单克隆抗体，而且传统单克隆抗体的制备耗时耗力且产量低，是α-溶血素基于免疫学检测中重要的问题。

5、1993年，hamers-casterman等首次从骆驼科动物，如单峰驼、双峰驼、美洲驼等的血清中发现了一种天然缺失轻链的抗体，称为重链抗体，除缺少轻链部分之外，这些重链抗体缺乏重链恒定区ch1，抗原结合位点仅由重链可变区构成，这种只由重链可变区构成的单域抗体是最小的天然的完整抗原结合片段，被命名为纳米抗体，其分子量约为15kda左右。纳米抗体具有与人免疫球蛋白链可变区相同的结构域：4个保守序列区(框架区-fr1/2/3/4)围绕3个高变性抗原结合区(互补决定区-cdr1/2/3)。cdr3是纳米抗体抗原识别和特异性的主要作用位点，平均长度为18个氨基酸，比小鼠和人的cdr3的氨基酸数目多。

6、纳米抗体与单克隆抗体和多克隆抗体相比，具有以下优点：

7、第一，结构简单，分子量小，尺寸小(2×2×4nm)，能够快速穿透组织，包括血脑屏障、炎症部位、肿瘤组织等。第二，亲和力高，识别常规抗体无法进入的抗原表位。第三，溶解性好，稳定性高，对极端环境有极强的耐受能力，仍能保持高度稳定的构象。第四，易于在多种宿主系统内表达，能够相对低成本、易于大规模生产。

8、由上述记载可知，纳米抗体对提高α-溶血素免疫学检测的灵敏度和特异性而言，具有巨大的发展前景，但目前未见有关金黄色葡萄球菌α-溶血素的纳米抗体的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供种金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体、制备方法及其应用，解决现有技术中的α-溶血素免疫学检测的灵敏度和特异性有待进一步提高的技术问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：

3、一种金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体，其特征在于，该抗体命名为金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体hla17；所述的金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体hla17的核苷酸序列为：

4、5’-gagtctgggggaggctcggtccaggctggagggtctctgagactctcctgttcagtctctggatatagcgtctataacacctgcatgggctggtaccgccagggtacaggccagaagcgcgacgaagtcgctattattgatagtgatggtagcacatactacgcggactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgacgacaattctttgaatctggaaatggacagcctgaaacctgacgacactggggtgtactactgtgggttagaacgaggcccgtgtagcttccgtggcgagtatgacggttctcgccgctactacggcatggactactggggcaaaggaacccaggtcaccgtctcctca-3’。

5、本发明还具有如下技术特征：

6、本发明还保护如上所述的金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体的制备方法，该方法先在驼源免疫的纳米抗体文库中淘选出能够与靶分子α-溶血素特异性结合的纳米抗体，然后通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式，获得金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体hla17。

7、该方法具体包括如下步骤：

8、步骤一，驼源淋巴细胞rna的获取。

9、步骤二，vhh基因片段的扩增：

10、步骤2.1，进行反转录pcr：

11、以步骤一获取的驼源淋巴细胞rna作为模板，进行反转录pcr合成cdna。

12、步骤2.2，进行巢式pcr的第一轮pcr扩增：

13、以步骤2.1中反转录合成的cdna作为模板，采用引物call001和引物call002，进行第一轮pcr扩增，鉴定并回收pcr产物。

14、所述的引物call001的序列为：

15、5’-gtcctggctgctcttctacaagg-3’。

16、所述的引物call002的序列为：

17、5’-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3’。

18、步骤2.3，进行巢式pcr的第二轮pcr扩增：

19、以步骤2.2中的回收到的pcr产物作为模板，采用引物vhh-for和引物vhh-rev，进行第二轮pcr扩增，鉴定并回收pcr产物，该pcr产物即为vhh基因片段。

20、所述的引物vhh-for的序列为：

21、5’-caggtgcagctgcaggagtctgggggagr-3’。

22、所述的引物vhh-rev的序列为：

23、5’-ctagtgcggccgctgaggagacggtgacctgggt-3’。

24、步骤三，纳米抗体文库的构建和鉴定：

25、将噬菌体展示载体以及步骤2.3获得的vhh基因片段进行酶切反应，并回收酶切产物，然后将噬菌体展示载体和vhh基因片段的酶切产物进行连接，并回收连接产物；采用电转化将连接产物转入感受态细胞中，经筛选培养后获得纳米抗体文库菌液；所述的纳米抗体文库菌液经再次筛选培养和噬菌体提取后，获得驼源单域重链抗体库。

26、步骤四，纳米抗体的亲和淘选及其鉴定：

27、采用α-溶血素，对步骤三获得的驼源单域重链抗体库进行多轮淘选，获得阳性克隆，然后对阳性克隆中提取出的质粒进行测序鉴定。

28、步骤五，hla17纳米抗体的大量制备：

29、将步骤四获得的hla17克隆的质粒转入宿主细胞中进行蛋白表达，经培养和提取后，获得金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体hla17；或将展示有阳性纳米抗体的噬菌体感染宿主细胞，经培养和提取后，获得含有金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体hla17的噬菌体扩增液。

30、本发明还保护如上所述的金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体用于金黄色葡萄球菌α-溶血素免疫学检测中的应用。

31、本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

32、(ⅰ)本发明的金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体，能特异性识别α-溶血素，较常规单克隆抗体用途更广，其识别α-溶血素的特异性更强。

33、(ⅱ)本发明的金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体，其相对分子质量小，稳定性强，能够采用原核表达系统进行大规模生产，成本低，产量高，具有广阔的应用前景。

34、以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。