鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒多重PCR检测引物探针、试剂盒及应用

本发明属于病毒检测，尤其涉及鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒多重荧光定量pcr检测引物探针、试剂盒及应用。

背景技术：

1、鸭坦布苏病毒病(duck tembusu virus disease,dtmuvd)是由新型黄病毒--鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus，dtmuv)引起的一种以蛋鸭产蛋骤降、肉鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征的急性传染病。该病自2010年在我国江苏、福建、浙江等省份陆续发生，并迅速蔓延至我国各个主要养鸭省市，现我省鸭坦布苏病毒感染严重，黄瑜等对江西省26个养殖场进行了鸭坦布苏病毒感染，其中有21个场检测出dtmuv阳性，该病给养鸭业造成了严重的经济损失。

2、新型鸭呼肠孤病毒病(new-type duck reovirus disease,ndrv)是由新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,ndrv)引起的一种以以肝脏出血坏死、脾脏肿大坏死为特征的新疫病，各个品种鸭均可发生，临床主要表现为雏鸭出雏率降低，免疫抑制和生长障碍等，新型鸭呼肠孤病毒感染自陈少莺等首次报道以来，现已在我国分布非常广泛，并已成为近几年养鸭业的一种危害严重的传染病。

3、鸭圆环病毒病(duck circovirus disease,ducv)是由鸭圆环病毒(duckcircovirus,ducv)感染引起的一种免疫抑制性疾病。该病主要侵害鸭免疫系统并抑制其功能，各品种和日龄鸭均可感染发病，临床上造成被感染鸭生长迟缓，并容易引起其他细菌和病毒的继发感染与混合感染，给养鸭业造成巨大的经济损失。

4、目前已有研究关于坦布苏病毒荧光定量rt-pcr方法的建立(王巧萍)和新型鸭弧肠孤病毒taqman的实时荧光定量spcr检测方法的建立(zhang)和鸭圆环病毒rt-qpcr检测方法的建立(彭艳伶)，但是鸭坦布苏病毒、新型鸭弧肠孤病毒和鸭圆环病毒的多重荧光定量pcr方法还未见报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒多重荧光定量pcr检测引物探针、试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

2、一种快速检测dtmuv、ndrv和ducv的多重引物和探针，其特征在于：包括dtmuv的上、下游引物、dtmuv特异性探针，ndrv的上、下游引物、ndrv特异性探针和ducv的上、下游引物、ducv特异性探针；

3、所述dtmuv的上、下游引物分、dtmuv特异性探针为：

4、上游引物：5’-acatctcggccaaagaagga-3’(seq id no.1)；

5、下游引物：5’-ggtcgcattaccttcaccac-3’(seq id no.2)；

6、dtmuv特异性探针：5’-tccagccgtgtcgtctgcgt-3’(seq id no.3)；

7、所述ndrv的上、下游引物、ndrv特异性探针为：

8、上游引物：5’-gttcccggtcatgtaccctt-3’(seq id no.4)；

9、下游引物：5’-tttcacgaaccgagagggtt-3’(seq id no.5)；

10、ndrv特异性探针：5’-tcggtcgctacgatcgcgct-3’(seq id no.6)；

11、所述ducv的上、下游引物、ducv特异性探针为：

12、上游引物：5’-gatcctctgatctggccgaa-3’(seq id no.7)；

13、下游引物：5’-ttccaatcacgttgcgtctc-3’(seq id no.8)；

14、ducv特异性探针：5’-tggctggcgtcccgctgact-3’(seq id no.9)。

15、该多重引物探针组的特异性好、灵敏度高。

16、在一些实施例中，dtmuv特异性探针在5’端标记6-fam荧光基团，在3’端标记bhq1淬灭基团；ndrv特异性探针在5’端标记vic荧光基团，在3’端标记bhq1淬灭基团；ducv特异性探针在5’端标记cy5荧光基团，在3’端标记bhq1淬灭基团。

17、本发明还提供一种上述检测dtmuv、ndrv和ducv的多重引物探针在制备特异性多重检测dtmuv、ndrv和ducv病毒试剂中的应用。

18、本发明还提供一种用于检测dtmuv、ndrv和ducv病毒的试剂盒，包括试剂2×aceqqpcrprobemastermix、cs2so4、50×roxreferencedye1和上述的多重引物和探针组。

19、在一些实施例中，所述cs2so4的浓度为1.5mmol-3.0mmol。

20、本发明还提供一种用于dtmuv、ndrv和ducv病毒多重荧光定量pcr的检测方法，配置多重pcr反应体系：检测样品cdna1.0μl、2×aceqqpcrprobemastermix10μl、浓度为10μm的dtmuv上下游引物各0.4μl、浓度为10μm的ndrv上下游引物各0.4μl和浓度为10μm的ducv上下游引物各0.4μl，浓度为10μm的dtmuv、ndrv和ducv特异性探针和浓度为10μm的探针各0.2μl、50×roxreferencedye10.4μl和ddh2o6.6μl。

21、在一些实施例中，多重荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，40次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。

22、与现有技术相比，本发明的优点及积极效果为：

23、为建立鉴别检测dtmuv、ndrv和ducv的方法，本申请中分别针对dtmuv的基因、ndrv的基因和ducv的基因，设计特异性引物和taqman探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时检测dtmuv、ndrv和ducv的taqman荧光定量rt-pcr方法。该方法具有特异、敏感、高效的优点。

技术特征：

1.一种快速检测dtmuv、ndrv和ducv的多重引物和探针，其特征在于：包括dtmuv的上、下游引物、dtmuv特异性探针，ndrv的上、下游引物、ndrv特异性探针和ducv的上、下游引物、ducv特异性探针；

2.根据权利要求1所述的多重引物和探针，其特征在于：

3.权利要求1或2所述的多重引物和探针在制备特异性多重检测dtmuv、ndrv和ducv试剂中的应用。

4.一种用于检测新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒的试剂盒，其特征在于，包括试剂2×aceq qpcr probe master mix、cs2so4、50×rox reference dye 1和权利要求1或2所述的多重引物和探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述cs2so4的浓度为1.5mmol-3.0mmol。

6.一种用于dtmuv、ndrv和ducv多重荧光定量pcr的检测方法，其特征在于，配置多重pcr反应体系：检测样品cdna 1.0μl、2×aceq qpcr probe master mix 10μl、浓度为10μm的dtmuv上下游引物各0.4μl、浓度为10μm的ndrv上下游引物各0.4μl和浓度为10μm的ducv上下游引物各0.4μl，浓度为10μm的dtmuv、ndrv和ducv特异性探针和浓度为10μm的探针各0.2μl、50×rox reference dye 10.4μl和ddh2o 6.6μl。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述多重荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，40次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。

技术总结
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒多重荧光定量PCR检测引物探针、试剂盒及应用。本申请中分别针对DTMUV、NDRV和DuCV，设计特异性引物和探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时检测DTMUV、NDRV和DuCV的荧光定量PCR方法。该方法具有特异、敏感、高效的优点。

技术研发人员：李海琴,康昭风,郭小权,谭佳,吴诚诚,谭美芳,黄江南,曾艳兵,杨群,张帆帆,李娜,韦启鹏
受保护的技术使用者：江西省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13