一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体

本发明属于抗体制备，具体涉及一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是一种高传染性和急性出血性病毒性疾病，感染发病后家猪死亡率接近100％。自1921年asf首次在肯尼亚发现以来，已经给各国生猪养殖行业造成了巨大破坏。

2、已有研究表明，造成非洲猪瘟的非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)的基因组为双股线状dna，大小170－190kb，但结构复杂。由于对病毒编码的多种蛋白功能研究较为有限，加上病毒变异等原因，使得目前尚缺乏商业化的较好用于预防非洲猪瘟的疫苗产品。

技术实现思路

1、结合相关噬菌体筛选技术，本技术目的在于提供一种针对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72蛋白具有高亲和力的特异性scfv-fc(single-chain variable fragment fc(fragmentcrystallization))抗体，从而为相关疫苗制备奠定一定技术基础。

2、本技术所采取的技术方案简述如下。

3、一种针对p72蛋白的抗非洲猪瘟病毒的抗体，该抗体属于一种单链抗体(即，仅包括重链可变区与轻链可变区)，其包括：重链可变区vh和轻链可变区vl；

4、所述重链可变区vh，长度为391bp，其核苷酸序列(如seq id no.1所示)，具体如下：

5、gaggagaagctggtggagtctggaggaggcctggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgtcggctctggattcaccttcagtagtacctacattaactgggtccgccaggctccagggaaggggctgcagtggcttgcagctattagtactagtggtggtagcacctactacacagactctatggagggccgattcaccatctccaaagacaactcccagaacacggcctatctgcaaatgaacagcctgagaacagaagacacggcccgctattactgtgcaaccatccggggttgctatagctatggtgctagttgctatcgttcctgggcgtcctttatggatctctggggcccaggcgttgaagtcgtcgtgtcctcag；

6、所述重链高变区vh所编码氨基酸序列，由130个氨基酸组成，其氨基酸序列，具体为：

7、eeklvesggglvqpggslrlscvgsgftfsstyinwvrqapgkglqwlaaistsggstyytdsmegrftiskdnsqntaylqmnslrtedtaryycatirgcysygascyrswasfmdlwgpgvevvvss；

8、该重链可变区vh含有三个高变区，对应碱基序列分别为：

9、457～480位处的:gattcaccttcagtatacctac(对应编码的氨基酸序列：gftfssty)；

10、532～555位处的：attagtactagtggtggtagcacc(对应编码的氨基酸序列为：istsggst)；

11、670～73位处的：gcaaccatccggggttgctatagctatggtgctagttgctatcgttcctgggcgtccttt

12、atggatctc(对应编码的氨基酸序列为：atirgcysygascyrswasfmdl)；

13、所述轻链可变区vl，长度为321bp，其核苷酸序列(如seq id no.2所示)，具体如下：

14、tcctatgagctgactcagccgtcttcagagtcagtggccttgggaagtacggccaagatcacctgctccggggatctgctggatgaaaaatatacgcaatggtaccagcagaagccaggccaggcccccctgctgctcatttataaggacaatgagcggccctcagggatccctgagcggttctctgggtccagctcagggaaaacggccaccctgaccatcactggggcccaggctgaggacgaggccgactactcgtgtcagtcaggtgacaggattaataatgctattttcggcggtgggacccatctgaccgtcctc；

15、所述轻链可变区vl由107个氨基酸组成，其氨基酸序列具体为：

16、syeltqpssesvalgstakitcsgdlldekytqwyqqkpgqapllliykdnerpsgip erfsgsssgktatltitgaqaedeadyscqsgdrinnaifgggthltvl；

17、该轻链可变区vl含有三个高变区，对应碱基序列分别为：

18、82～99位处的：ctgctggatgaaaaatat(对应编码的氨基酸序列为:lldeky)；

19、151～159位处的：aaggacaat(对应编码的氨基酸序列为:kdn)；

20、268～297位处的：cagtcaggtgacaggattaataatgctat(对应编码的氨基酸序列为:为qsgdrinnai)；

21、应用时，重链可变区vh和轻链可变区vl之间连接子序列可参考为：ggtggcggcggcggcggctctggtggtggtggttcaggaggaggaggaggaagc；

22、(其对应编码的氨基酸序列为：ggggggsggggsgggggs)。

23、在上述轻链可变区vl、重链可变区vh基础上，结合fc片段，本技术提供了一种抗非洲猪瘟p72蛋白的scfv-fc抗体，其碱基序列长度为1494bp，碱基序列如seq id no.3所示，具体为：

24、atggcctcctatgagctgactcagccgtcttcagagtcagtggccttgggaagtacggccaagatcacctgctccggggatctgctggatgaaaaatatacgcaatggtaccagcagaagccaggccaggcccccctgctgctcatttataaggacaatgagcggccctcagggatccctgagcggttctctgggtccagctcagggaaaacggccaccctgaccatcactggggcccaggctgaggacgaggccgactactcgtgtcagtcaggtgacaggattaataatgctattttcggcggtgggacccatctgaccgtcctcggtggcggcggcggcggctctggtggtggtggttcaggaggaggaggaggaagcgaggagaagctggtggagtctggaggaggcctggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgtcggctctggattcaccttcagtagtacctacattaactgggtccgccaggctccagggaaggggctgcagtggcttgcagctattagtactagtggtggtagcacctactacacagactctatggagggccgattcaccatctccaaagacaactcccagaacacggcctatctgcaaatgaacagcctgagaacagaagacacggcccgctattactgtgcaaccatccggggttgctatagctatggtgctagttgctatcgttcctgggcgtcctttatggatctctggggcccaggcgttgaagtcgtcgtgtcctcagctagtggccaggccggcctggcatctgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa；

25、该碱基序列对应所编码氨基酸序列，长度为498个氨基酸，氨基酸序列具体为：

26、masyeltqpssesvalgstakitcsgdlldekytqwyqqkpgqapllliykdnerpsgiperfsgsssgktatltitgaqaedeadyscqsgdrinnaifgggthltvlggggggsggggsgggggseeklvesggglvqpggslrlscvgsgftfsstyinwvrqapgkglqwlaaistsggstyytdsmegrftiskdnsqntaylqmnslrtedtaryycatirgcysygascyrswasfmdlwgpgvevvvssasgqaglasepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

27、所述抗非洲猪瘟p72蛋白的scfv-fc抗体，通过如下步骤制备获得：

28、(一)制备重组表达载体

29、首先，获得正确的抗体核苷酸序列；

30、随后，以真核表达质粒(例如采用pinfuse质粒)为载体，重组上述抗体核苷酸序列，构建获得可翻译表达seq id no.3所示核苷酸序列的重组真核表达载体；

31、以质粒pinfuse-migg2b-fc2为例(invivogen公司产品)为例，重组时，重组seqidno.1和seq id no.2核苷酸序列即可(若采用不含fc片段的质粒载体，则需重组seqidno.3所示序列)；具体重组操作参考如下：

32、利用限制性内切酶ecori和ncoi分别真核表达载体pinfuse-migg2b-fc2进行酶切并回收酶切产物，再利用t4 dna连接酶将所回收酶切产物与seq id no.1和seq id no.2核苷酸序列进行连接；

33、连接完成后，将连接产物进行电转化入tg1感受态细胞，并进行筛选和鉴定，确保质粒重组正确，并提取重组后表达载体质粒备用；

34、(二)进行抗体蛋白表达

35、参照sinobiological的smm 293-tii expression medium(smm 293-tii表达培养基)和sinofection转染试剂说明书，利用sinofection转染试剂，将步骤(一)中构建正确的重组质粒载体转化细胞状态良好的293f细胞，培养5-7天后，收集含有scfv-fc重组抗体的培养物；

36、(三)纯化获得scfv-fc抗体

37、对步骤(二)所得培养物，4℃、5000g离心10min，去除细胞沉淀，留上清，上清即为含有单链scfv-fc抗体的溶液；

38、进一步利用15kd截留分子量的millipore超滤离心管对上清进行浓缩处理后，利用proteina亲和填料对其进行纯化，即可获得纯化的scfv-fc抗体。

39、现有技术中，由于对感染非洲猪瘟病毒(asfv)后生猪的先天免疫和适应性免疫的研究较为有限，因此，深入探究病毒感染后各种抗体蛋白的表达水平，了解这些抗体蛋白间相互作用情况，对于asfv感染的准确诊断、关键抗原表位的挖掘以及疫苗设计具有重要的技术意义。

40、本技术中，基于现有成熟噬菌体抗体库筛选技术，筛选获得了一个对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72蛋白具有高亲和力的特异性scfv-fc抗体。该抗体属于一种只含有重链可变区与轻链可变区的单链抗体，而该单链抗体不仅保留了对抗原的亲和活性，而且由于具有分子量小、穿透力强的技术优点，因此在asfv的诊断和治疗中具有较好的应用潜力。初步实验结果表明，该单链抗体较好保留了对抗原的亲和活性，可以特异性的识别并结合衣壳蛋白p72；而且由于其分子量小、穿透力强，因此易于通过基因工程技术手段借助于原核或真核表达系统进行大量制备，可为非洲猪瘟病毒的检测、预防和治疗药物的开发奠定一定技术基础，因此具有较好的应用前景。