一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型Tag/Catcher共价连接体系

本发明涉及一种可在温和溶液条件下用于疫苗抗原等蛋白共价连接的新型tag/catcher共价连接体系，属于生物。

背景技术：

1、sars-cov-2属于巢病毒目冠状病毒科的一种单股正链rna病毒，其具有变异快、宿主多及较强宿主适应性等特点。如今已出现包括alpha、beta、delta、omicron等在内的众多突变体，他们感染能力、致病性各有不同，类型众多的突变株为抗疫工作(疫苗、特效药研发等)带来巨大挑战，已接种疫苗的人群也并非完全安全，他们仍有感染新冠的风险。2022年6月23日刊登于cell的一篇文章证实串接不同抗原的嵌合疫苗相比同抗原二聚体疫苗拥有更广泛的免疫保护能力[2]，这表明将不同受体结合结构域(rbd)共价串联是提高疫苗广谱性的有效方法之一，可使用何种方法能高效准确的将更多的疫苗抗原蛋白整合又是一大难题。

2、蛋白质生物耦联通常是利用天然氨基酸的化学性质(如氨基、羧基和巯基等)，通过催化共价化学键的形成而实现。近些年，通过形成异肽键(iso-peptide)而催化蛋白间共价连接的tag/catcher体系越来越引起人们的关注，其中研究最多且深入的既是spytag/spycatcher共价连接系统[3-4]。在蛋白质内部，各氨基酸之间通过α-氨基与α-羧基脱水缩合而形成的共价键称之为肽键，而由赖氨酸侧链上的氨基(-nh2)与天冬酰胺的侧链氨基或天冬氨酸的侧链羧基(-cooh)间发生缩合反应，失去一个nh3或一个h2o分子而形成的共价键称之为异肽键，这一缩合反应通常是由邻近的谷氨酸催化而自发发生的。现有研究显示，在一些革兰氏阳性菌的菌毛蛋白和粘附蛋白中，这种自发形成的异肽键的存在极为普遍。而tag/catcher共价连接系统就是利用此类异肽键，对蛋白进行拆分后所开发形成的[5]。

3、目前比较成熟的tag/catcher系统主要有spytag/spycatcher和snooptag/snoopcatcher两种。spy系统采用的是酿脓链球菌纤连蛋白结合蛋白fbab的cnab2结构域，将cnab2拆分为两部分，其一为n端含116个氨基酸残基的多肽(spycatcher，含第31位的赖氨酸和第77位的谷氨酸)，其二为c端含13个氨基酸残基的多肽(spytag，含第117位的天冬氨酸)[5]。而snoop系统采用的是肺炎链球菌的菌毛粘附素rrga，将rrga的d4结构域拆分为n端含106个氨基酸残基的多肽(snooptag，含第742位的赖氨酸)和c端含12个氨基酸残基的多肽(snoopcatcher，含第803位的谷氨酸、第854位的天冬酰胺)两部分[6]。

4、tag与catcher在溶液中，能够快速地形成不可逆的异肽键这一共价连接，因此，将分别融合了tag和catcher的两种蛋白组分混合在一起，二者即可被迅速地连接起来，且由于异肽键的形成不可逆，因此这种连接极度稳定。目前，这一共价连接体系已经在蛋白质改造等工程手段中得到了广泛的应用。比如，通过在蛋白质的n端和c端分别融合tag和catcher，使蛋白质自发成环，能够显著提高蛋白质的稳定性；将其与水凝胶中的多聚材料进行融合，使其携带特定蛋白，能够模仿特定的细胞微环境；利用该系统使抗原与纳米颗粒融合，实现抗原聚集，能够显著增强免疫效果；将其与荧光探针融合，被用于研究革兰氏阴性菌外膜上的致病因子，探究膜蛋白的形态、动力学等[3,6]。

5、通过模块化生产蛋白，配合连续交替使用spytag/spycatcher与snooptag/snoopcatcher，可以做到程序化生产共价连接的多聚蛋白，比如，可以藉此开发不同新冠病毒突变株rbd的共价连接嵌合疫苗等，以提高其广谱性，实现通用疫苗的研发。但仅有的两种tag/catcher最多只能在一锅反应(one-pot reaction)中连接3种蛋白，而通过反复使用spycatcher-snoopcatcher进行链延长，虽然可以共价串联更多的目的抗原蛋白，但反应过程必须靶向每一个目的蛋白逐个进行，并且每进行一步，均需要纯化以去除未能连接的蛋白，因此无法实现一锅反应，其步骤冗长，造成大量损失。因此，我们通过开发更多的tag/catcher连接对，且彼此不发生交叉反应，可以实现在一锅反应中快速串联更多蛋白，或是减少链延长、纯化步骤的重复次数，在各种蛋白质生物耦联的应用场景中，尤其是不同疫苗抗原的共价连接以增强广谱性的通用疫苗研发中，具有重要的意义和潜在应用价值。

6、[1]worldhealth organization.who coronavirus disease(covid-19)dashboard.https://covid19.who.int/

7、[2]xu k,gao p,liu s,lu s,leiw,zhengt,liu x,xiey,zhao z,guo s,tang c,yangy,yuw,wangj,zhouy,huang q,liu c,any,zhang r,hany,duan m,wang s,yang c,wuc,liu x,she g,liuy,zhao x,xu k,qi j,wu g,peng x,dai l,wang p,gaogf.protective prototype-beta and delta-omicron chimeric rbd-dimervaccinesagainst sars-cov-2.cell.2022jun23；185(13):2265-2278.e14.

8、[3]hatlem d,trunk t,linke d,et al.catching a spy:using thespycatcher-spytag and related systems forlabelingandlocalizingbacterialproteins.intjmol sci.2019,20.

9、[4]reddington sc,howarthm.secrets ofa covalentinteractionforbiomaterials andbiotechnology:spytag and spycatcher.currentopinion inchemicalbiology.

10、[5]zakeri b,fierer jo,celik e,et al.peptide tag forming a rapidcovalent bond to a protein,through engineeringabacterialadhesin.procnatlacadsci usa.2012,109:e690-e7.

11、[6]veggiani g,nakamura t,brenner md,et al.programmable polyproteamsbuilt using twin peptide superglues.procnatlacadsciusa.2016,113:1202-1207.

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一对肽连接体，包含肽标签和结合配偶体，其中肽标签和结合配偶体可以通过在包含所述结合配偶体中的一个反应残基和包含在所述肽标签中的另一个反应残基之间自发形成异肽键而彼此结合，肽连接体选自(a)或(b)：

2、(a)肽标签的氨基酸序列如seq id no.1所示，结合配偶体的氨基酸序列如seqidno.2所示；

3、(b)与(a)中肽标签或结合配偶体具有至少80％同源性的变体，其中，肽标签的第9位始终为赖氨酸，结合配偶体的第113位始终为天冬酰胺，第45位始终为谷氨酸。

4、本发明的第二个目的是提供一种结合配偶体，所述结合配偶体能够通过一个反应残基与包含一个反应残基的肽标签通过自发形成异肽键而结合，所述结合配偶体选自(a)或(b)：

5、(a)结合配偶体的氨基酸序列如seq id no.2所示；

6、(b)与(a)中结合配偶体具有至少80％同源性的变体，其中，结合配偶体的第113位始终为天冬酰胺，第45位始终为谷氨酸。

7、本发明的第三个目的是提供一种肽标签，所述肽标签能够通过一个反应残基与权利要求2所述的结合配偶体通过自发形成异肽键而结合，所述肽标签选自(a)或(b)：

8、(a)肽标签的氨基酸序列如seq id no.1所示；

9、(b)与(a)中肽标签具有至少80％同源性的变体，其中，肽标签的第9位始终为赖氨酸。

10、本发明的第四个目的是提供一种组合物，所述组合物包括连接有上述结合配偶体的第一目标物以及连接有上述肽标签的第二目标物。

11、在一种实施方式中，所述第一目标物或第二目标物包括核酸分子、蛋白质、肽、小分子有机化合物、荧光团、金属-配体复合物、多糖、纳米颗粒、纳米管、聚合物、细胞、病毒、病毒样颗粒或其组合。

12、在一种实施方式中，所述病毒包括新冠病毒、流感病毒、轮状病毒、乙肝病毒。

13、本发明的第五个目的是提供编码上述肽连接体或上述肽标签或上述结合配偶体的基因。

14、本发明的第六个目的是提供一种载体，包括表达上述肽标签的载体或表达上述结合配偶体的载体。

15、在一种实施方式中，所述肽标签或结合配偶体上连接有核酸分子、蛋白质、肽、小分子有机化合物、荧光团、金属-配体复合物、多糖、纳米颗粒、纳米管、聚合物、细胞、抗原、病毒、病毒样颗粒或其组合。

16、本发明的第七个目的是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述肽链接对，或上述基因，或上述组合物，或上述载体。

17、本发明的第八个目的是提供上述肽链接对，或上述结合配偶体，或上述肽标签用于以下任一用途：

18、(1)通过异肽键连接一对目标物；或

19、(2)通过多个不同异肽键连接一对以上目标物。

20、在一种实施方式中，(1)中，一对目标物包括连接有上述结合配偶体的第一目标物以及连接有肽标签的第二目标物。

21、在一种实施方式中，(2)中，通过多对肽链接对自发形成多个异肽键连接一对以上目标物，其中，连接一对目标物的肽链接对与另一对目标物的肽链接对之间正交。

22、在一种实施方式中，所述肽链接对选自spytag/spycatcher或者snooptag/snoopcatcher。

23、本发明的第九个目的是提供上述肽链接对，或上述结合配偶体，或上述肽标签，或上述组合物，或上述基因，或上述载体，或上述宿主细胞在制备疫苗、融合蛋白标签、检测试剂盒、药物、多聚蛋白或标记物试剂中的应用。

24、有益效果：

25、本发明提供的lagtag/lagcatcher是全新发现的、能够有效完全正交于其他现有tag/catcher的不可逆共价连接对(即与现有的tag/catcher对无交叉反应)。反应仅需将分别融合有lagtag和lagcathcer的分子混合即可自发进行。

26、本发明提供的lagtag/lagcatcher增加了一锅反应底物的种类，减少固相延长蛋白链中链生长、纯化步骤的重复次数，进而用于各种蛋白质生物耦联的应用场景中，如多聚蛋白生产、活细胞蛋白标记、嵌合抗原疫苗制备等。