一种构建乳腺癌内分泌治疗耐药并筛选药物的方法

本发明属于医药，具体涉及一种构建乳腺癌内分泌治疗耐药并筛选药物的方法。

背景技术：

1、cdk4/6抑制剂以及氟维司群是针对于er阳性晚期乳腺癌治疗的首选一线治疗药物。当一线治疗进展后，美国asco指南推荐选择pik3ca抑制剂或mtor抑制剂，但这两种药物在我国未上市或未获批乳腺癌适应症，患者往往只能接受副作用更大的化疗治疗方案，亟需新的药物用于克服cdk4/6抑制剂以及氟维司群的耐药问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种构建乳腺癌内分泌治疗耐药并筛选药物的方法，该方法能够获得多种可用于克服内分泌治疗耐药的药物，公开了i-brd9或sgc-cbp30或unc1999单独用药以及联合用药，能够显著抑制耐药细胞的生长，有效地治疗cdk4/6抑制剂获得性或氟维司群获得性耐药乳腺癌。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、一种构建乳腺癌内分泌治疗耐药并筛选药物的方法，包括：

4、1）通过耐药乳腺癌细胞的构建获得cdk4/6抑制剂耐药细胞和氟维司群耐药细胞；

5、2）取cdk4/6抑制剂耐药细胞和氟维司群耐药细胞以及mcf-7亲本株接种培养，加入待筛药物处理培养，并使用具有10x物镜的活细胞分析系统分析细胞增殖状态，筛选出在耐药细胞中敏感的药物；

6、所述药物包括brd9抑制剂或cbp/p300抑制剂或ezh1/2抑制剂。本发明通过er阳性的mcf-7乳腺癌细胞诱导成功构建了cdk4/6抑制剂、氟维司群药物耐药的乳腺癌细胞株，并利用小分子药库筛选，获得多种可用于克服内分泌治疗耐药的新型药物。本发明提供的方法方便快捷，适合用于快速筛选药物；所筛选得到的药物对于耐药性乳腺癌细胞，如cdk4/6抑制剂耐药细胞和氟维司群耐药细胞，具有增敏效果以及加强的癌症治疗效果。同时，根据本发明提供的筛选方法，可以针对特定的耐药性药物，精准、快速、高效地得到匹配的增敏性药物，从而更有利于针对特定耐药乳腺癌患者进行精准化医学治疗，具有广泛的应用前景。

7、进一步的，上述方法具体为：

8、步骤一：耐药细胞系诱导

9、取对数生长期的mcf-7乳腺癌细胞，采用含10%胎牛血清的dmem培养基，在37℃、5%co2培养箱中培养；当mcf-7乳腺癌细胞正常贴壁生长后，加入cdk4/6抑制剂，使培养基中的浓度达到0.5μm，2-3天更换一次培养基，并维持cdk4/6抑制剂的浓度；起初，大量贴壁细胞被杀伤漂浮至培养基中，仅有少数细胞仍维持贴壁状态。经过数次更换培养基后，培养皿中仅剩存少许贴壁细胞，定期观察细胞生长状态，直至出现细胞开始增殖；当mcf-7细胞在cdk4/6抑制剂0.5μm浓度下，出现持续增殖状态，按照1:2至1:3比例传代，并维持抑制剂浓度，获得可稳定传代细胞株；逐步增大cdk4/6抑制剂浓度，从0.5μm增大至2μm，在高浓度下mcf-7乳腺癌细胞仍可保持增殖及稳定传代，通过mtt方法检测此时的细胞株与亲本株对于cdk4/6抑制剂的敏感性，当ic50的差异，达到3-5倍以上，即可认定耐药细胞株构建成功；

10、按照上述方法，同样成功构建氟维司群耐药的mcf-7乳腺癌细胞，其最终药物维持浓度为1μm；

11、步骤二：筛选药物

12、多孔板上每孔接种1000个乳腺癌细胞，待细胞粘附在板上后，加入溶解在dmso中的小分子抑制剂至终浓度为5μm；dmso作为对照；然后将细胞置于培养箱中处理5d，并使用具有10x物镜的活细胞分析系统分析细胞增殖状态，筛选出在耐药细胞中敏感的药物。

13、本发明又公开了brd9抑制剂或cbp/p300抑制剂或ezh1/2抑制剂在制备治疗cdk4/6抑制剂获得性耐药细胞和/或氟维司群获得性耐药细胞抗药性药物中的应用。本发明公开了brd9抑制剂或cbp/p300抑制剂或ezh1/2抑制剂单独用药，以及cbp/p300抑制剂和ezh1/2抑制剂联合用药，作为cdk4/6抑制剂获得性耐药细胞抑制剂和/或氟维司群获得性耐药细胞抑制剂，能够显著抑制耐药细胞的生长，有效地治疗cdk4/6抑制剂获得性和/或氟维司群获得性耐药乳腺癌，并且联合用药的治疗效果更佳；本发明筛选得到的药物原料易得，使用方法简单。本发明提供的用药方案能够有效逆转cdk4/6抑制剂耐药和/或氟维司群耐药，为治疗耐药乳腺癌提供一种全新用药方案，同时为临床治疗提供了一种新思路。

14、进一步的，cdk4/6抑制剂获得性耐药细胞或氟维司群获得性耐药细胞为mcf-7细胞药物筛选培养获得。

15、进一步的，i-brd9或sgc-cbp30或unc1999用量均为标准临床用药剂量。

16、需要说明的是，上述药物以200~500mg/天的剂量给药于患者。

17、进一步的，上述药物以200mg/天、300mg/天、400mg/天或500mg/天的剂量给药于患者。

18、基于本发明方法筛选的药物可以一次或多次给药于患者。在其中化合物被多次给药的那些实施方式中，它们可以以设定的间隔施用，例如每天、每隔一天、每周或每月。或者，它们可以以不规则的间隔给药，例如基于症状、患者健康情况等根据需要给药。治疗有效量的组合可以每天一次给药（q.d.），连续给药1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天或至少15天。

19、需要说明的是，给药途径包括但不限于局部给药、口服给药、皮内给药、肌内给药、腹膜内给药、静脉内给药、膀胱内输注、皮下给药、经皮给药和经粘膜给药。

20、进一步的，cdk4/6抑制剂包括palbociclib。

21、进一步的，brd9抑制剂包括i-brd9。

22、进一步的，cbp/p300抑制剂包括sgc-cbp30。

23、进一步的，ezh1/2抑制剂包括unc1999。

24、本发明还公开了sgc-cbp30和unc1999联合用药在制备治疗cdk4/6抑制剂获得性耐药细胞和/或氟维司群获得性耐药细胞抗药性药物中的应用。

25、本发明又公开了阿魏酸衍生物和i-brd9抑制剂联合用药在制备治疗cdk4/6抑制剂获得性耐药细胞和/或氟维司群获得性耐药细胞抗药性药物中的应用。

26、进一步的，上述阿魏酸衍生物为阿魏酸酯类衍生物，由香叶基香叶醇通过酯化反应修饰阿魏酸获得。本发明采用香叶基香叶醇对阿魏酸进行酯化改性，制备获得阿魏酸衍生物，具有良好的生物活性，对耐药细胞的生长具有一定的抑制效果，与i-brd9抑制剂联合用药，能够有效地治疗cdk4/6抑制剂获得性耐药乳腺癌，并且联合用药的治疗效果更佳。

27、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

28、本发明公开了一种构建乳腺癌内分泌治疗耐药并筛选药物的方法。cdk4/6抑制剂、氟维司群为激素受体（er）阳性晚期乳腺癌一线治疗的首选药物，当出现治疗耐药后，目前可选的药物仍非常有限。本发明首先构建了两种药物的耐药细胞株，通过大剂量的药物，杀伤多数亲本株细胞，保留存活细胞，并通过逐渐提升药物浓度，诱导可稳定传代的细胞，最终获得耐药细胞系。通过多个小分子抑制剂的药库筛选，获得数个可用于内分泌耐药后的新型药物，如i-brd9，sgc-cbp30，unc1999等多种不同作用机制的小分子抑制剂。本发明构建乳腺癌内分泌耐药细胞株并通过小分子抑制剂药库筛选，获得可以用于治疗内分泌治疗耐药的新型药物。

29、因此，本发明提供了一种构建乳腺癌内分泌治疗耐药并筛选药物的方法，该方法能够获得多种可用于克服内分泌治疗耐药的药物，公开了i-brd9或sgc-cbp30或unc1999单独用药以及联合用药，能够显著抑制耐药细胞的生长，有效地治疗cdk4/6抑制剂获得性或氟维司群获得性耐药乳腺癌。