一种靶向IGF2BP3蛋白的单链寡核苷酸及其应用

本发明涉及含核酸的抗肿瘤药物，尤其涉及一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸及其应用。

背景技术：

1、原发性肝癌占我国恶性肿瘤发病率的第四位，致死率高居第二位，严重威胁我国人民的生命和健康。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)(以下简称肝癌)约占原发性肝癌的75％-85％。目前临床中用于治疗肝癌的首选方式为手术切除，但80％的肝癌患者发现时已是中晚期而失去手术机会，导致患者5年生存率极低。为了延长中晚期肝癌患者生存期，近几年一些靶向药物先后进入临床实验，但是它们对延长患者生存期的作用非常有限。因此，迫切需要发现新的治疗靶点与抗肿瘤药物。

2、rna结合蛋白(rna binding protein,rbp)是一类能够结合单链或双链rna的蛋白。它们通常具有模块化结构：含有一个或多个rna结合结构域(rna binding domain，rbd)以及其它功能结构域。常见的rna结合结构域有rna识别结构域(rna recognition motif，rrm)、kh结构域(kh domain)、冷休克结构域(cold shock domain,csd)、双链rna结合结构域(dsrbd)、锌指蛋白(zinc finger)等。rna结合蛋白的这种模块化结构决定了它们特异识别rna靶标以及在基因表达调控中发挥重要生物学功能。利用rna结合蛋白能够特异地、高度亲和地识别不同rna基序这一特点，科研人员通过设计并合成带有rna结合蛋白的rna结合基序的寡核苷酸，并将它用来靶向rna结合蛋白，从而干扰它在细胞中的功能发挥。

3、胰岛素样生长因子ii mrna结合蛋白(insulin-like growth factor 2mrna-binding protein 3，igf2bp3，imp3)是一个高度保守的rna结合蛋白家族，由580个氨基酸残基组成，包括六个典型的rna结合域组成，其中包括n末端两个rna识别基序(rrm)结构域和c末端四个k同源(kh)结构域，3’utrs富含au核苷酸，含有8个auuua和4个auuuuua重复区和1个poly(a)18延伸区，开放阅读框编码的蛋白质产物为580个氨基酸，约64kda，通过特异性识别和结合rna，发挥剪接、运输、定位、翻译和降解等生物学功能。igf2bp3是家族成员中与肿瘤联系最为紧密的rbp，主要在胚胎发育过程中表达，在成体组织中表达极低，在细胞恶性转化过程中重新高表达。多项研究显示，igf2bp3在多种肿瘤中的重新合成或异常表达严重影响恶性肿瘤的发生发展，且肝癌组织中igf2bp3表达增高与肝癌转移潜能呈正相关。上述研究提示igf2bp3可能是一种潜在的治疗性靶点。

4、非专利文献《mir1425p通过靶向igf2bp3抑制人肝癌细胞生长的研究》中，虽然mir1425p可抑制igf2bp3蛋白表达，但其在抑制igf2bp3蛋白rna结合活性的同时，也抑制了igf2bp3蛋白的其他所有活性。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种结合igf2bp3蛋白的核酸分子及其应用，其提供了一种新的核酸分子治疗肝癌的方案。

2、本发明一方面，提供一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸由如下任一编码得到：

3、1)seq id no.1所示的核苷酸序列；

4、2)seq id no.1所示的核苷酸序列经化学修饰得到的核苷酸序列；

5、3)seq id no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；

6、4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

7、在本发明的一些实施方案中，所述化学修饰选自下列至少一种：

8、通过在核苷酸中糖结构的2’-碳位点处用-ch3、-och3、-f、-o-2-甲氧基乙基进行修饰。

9、优选地，在本发明的一些实施方案中，通过在核苷酸中糖结构的2’-碳位点处用-ch3进行修饰。

10、本发明又一方面，提供一种生物材料，包括上述的一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸，

11、其中，所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、宿主细胞。

12、本发明又一方面，提供一种药物组合物，包括上述的一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸。

13、本发明又一方面，提供上述一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸在负调控igf2bp3蛋白表达中的应用。

14、本发明又一方面，提供上述一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸在制备治疗肿瘤药物中的应用。

15、优选地，在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤为肝癌。

16、本发明又一方面，一种抑制肝癌细胞增殖或在抑制肝癌细胞侵袭的方法，将上述一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸施用于所述肝癌细胞。

17、本发明又一方面，提供上述一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸在制备用于检测igf2bp3蛋白或肝癌探针中的应用。

18、术语“寡核苷酸”是指两个或更多个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性核苷酸分子。在实验室中寡核苷酸通常通过固相化学来合成。本发明的寡核苷酸通过化学合成和纯化得到，包含一个或多个修饰的核苷酸。

19、术语“化学修饰”是指在核苷酸中糖结构的2’-碳位点处具有除了h或-oh之外的取代基，比如2’-ch3、2’-och3、2’-f、2’-o-2-甲氧基乙基等。

20、术语“重组dna”是指在体外由目的dna片段与能自主复制的遗传元件(比如载体)连接形成的重组dna，可在宿主细胞中复制、扩增得到目的dna片段。

21、术语“表达盒”是指多核苷酸序列，所述多核苷酸至少包含启动子的表达调节区和可操作地连接至所述表达调节区的用于表达目标产物的核酸。所述表达盒能包括在表达载体中。引入宿主细胞时，表达盒能指导细胞表达目标产物，

22、术语“转座子”是指能够从供体多核苷酸(例如载体)中切除且整合到靶点(例如细胞的基因组dna)中的多核苷酸。

23、术语“宿主细胞”包括细菌、酵母细胞、真菌细胞、cho、人类细胞等，相较于其所来源的天然存在的生物体，所述宿主细胞已经遗传改变、修饰或工程改造，以便其展现经改变、修饰或不同的基因型和/或表型。

24、本发明的技术原理为：本发明的靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸能够结合igf2bp3蛋白的rna结合域，抑制其rna结合活性，进而抑制下游基因c-myc、pdl1的表达，促进e-cadherin的表达提高，进而达到抑制肝癌细胞增殖和侵袭的目的。

25、与现有的技术中靶向igf2bp3的sirna或反义寡核苷酸(比如mir1425p或mir-127-5p)相比，本技术的靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸(也称为诱骗寡核苷酸)具有更好的技术效果。具体来说，首先，诱骗寡核苷酸针对igf2bp3的rna结合域，只抑制其rna结合活性，而不干扰igf2bp3的其他活性，如蛋白质-蛋白质相互作用。与基因敲除技术不同，基因敲除技术抑制蛋白质的表达，从而抑制igf2bp3的所有活性。因此，诱骗寡核苷酸的副作用少于完全敲除。最后，诱骗寡核苷酸是单链rna分子，已被证明(polina denichenko,naturecommunications volume 10,article number:1590(2019))比双链sirna分子更有效地将其成功地输送到人体各器官中。

26、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

27、本发明考察了靶向阻断igf2bp3蛋白对其识别的mrna结合能力在肝癌增殖和转移中的应用价值，结果表明将靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸(即带有igf2bp3蛋白rna结合基序的寡核苷酸)转染人肝癌细胞，能够显著抑制肝癌细胞的增殖及迁移。

28、此外，靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸能抑制小鼠体内移植细胞成瘤及转移，提示靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸具有通过特异性靶向igf2bp3蛋白来抑制肿瘤细胞增殖和转移的功能，具有推向临床治疗的潜力。