优化的雌鱼育性控制的方法及应用

本发明涉及基因工程和分子生物学领域，尤其涉及一种优化的雌鱼育性控制的方法及应用。

背景技术：

1、近些年来，为了提高水产养殖品种的生长速度，增加水产养殖产量，增强抗病能力，改善水产养殖品种的品质，众多学者利用遗传操作技术在水产养殖相关领域开展了广泛的研究。但遗传操作的水产养殖材料一旦释放或逃逸到自然水体中，则有可能与野生型群体发生自然繁殖，导致遗传操作位点渐渗至自然界野生型群体中，从而破坏了天然的种群遗传结构和遗传多样性，造成人工遗传操作位点对野生物种的“基因污染”，产生难以预见和难以消除的生态安全风险，这阻碍着基于遗传操作的新型育种技术和遗传操作的水产养殖品种在水产养殖行业中的应用及推广。

2、育性控制是指人为干预目标物种的育性，使其实现育性人工可控的技术。通过建立和优化育性控制技术能有效地控制这些遗传操作水产养殖材料的育性，防止人工遗传操作位点在野生型群体中发生漂移造成的“基因污染”，是实现基因编辑等新型育种技术在生产性状高效改良的产业育种中应用的关键，并以此保障天然种群的生态安全。同时，也能有效保护经过遗传改良性状的水产品种的知识产权，保障种业科技发展动力，促进水产养殖行业绿色健康的可持续发展。

3、为了进行育性控制，申请号为201310049161.5的发明专利公开了一种控制鱼类生殖的方法，该专利通过分别构建转gal4基因斑马鱼纯合子和转uas-antisense dnd基因斑马鱼纯合子，再将二者进行杂交，获得的两系杂交子代生殖败育。该方法通过性腺组织切片发现两系杂交雌鱼卵巢中有3％左右的卵细胞处于第四发育期，两系杂交雄鱼精巢中小叶腔的大小和数量均约为对照的10％左右。该方法需要构建两种转基因鱼，步骤较为繁琐，且涉及外源基因的导入，因此，是否能在经济鱼类中开展应用还有待进一步研究。

4、申请号为202111369875.5的发明专利公开了泥鳅cdk1基因及其在不育多倍体泥鳅分子育种中的应用，该专利利用crispr/cas9技术对多倍体泥鳅的cdk1基因进行敲除，从而获得不育多倍体泥鳅。但是，虽然该方法能够获得不育个体，但是并没有育性挽救的方法，因此，无法持续获得不育子代供养殖实践，必须不断通过杂合子亲本的交配和对子代进行筛选，获得纯合子不育子代，方能实现不育子代供养殖使用，这对于水产养殖鱼类的大量苗种供应，人力、物力等经济成本在规模化养殖实践中显然难以承受。因此，难以在水产养殖动物中进行推广应用。

5、有鉴于此，有必要设计一种优化的雌鱼育性控制的方法及应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种优化的雌鱼育性控制的方法及应用。本发明通过利用基因编辑技术特异性切割鱼类的性腺孕激素合成的关键编码基因，高效地获得不育的雌鱼；并采用促性腺激素以及促进卵母细胞成熟和排卵的制剂对不育的雌鱼进行处理，较好的挽救了雌鱼的育性，以实现对雌鱼育性的控制。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种优化的雌鱼育性控制的方法，具体为：

3、采用基因编辑技术敲除鱼类的性腺孕激素合成的关键编码基因，阻断鱼类孕激素的合成，以获得缺失纯合子不育雌鱼；

4、采用促性腺激素以及促进卵母细胞成熟和排卵的制剂对所述缺失纯合子不育雌鱼进行处理后，所述缺失纯合子不育雌鱼能够恢复与野生型雄鱼自然交配、产卵的能力。

5、作为本发明的进一步改进，所述性腺孕激素合成的关键编码基因为孕激素合成通路的调节蛋白编码基因(steroidogenic acute regulatory protein,star)，即star基因。

6、作为本发明的进一步改进，所述雌鱼育性控制的方法具体包括如下步骤：

7、s1、采用基因编辑技术敲除鱼类中的star基因，获得star缺失纯合子鱼；

8、s2、从所述star缺失纯合子鱼中筛选出star缺失纯合子雌鱼；所述star缺失纯合子雌鱼的卵母细胞成熟受阻且排卵障碍，无法自然繁殖；

9、s3、采用促性腺激素以及促进star缺失纯合子雌鱼卵母细胞成熟和排卵的制剂处理所述star缺失纯合子雌鱼；

10、s4、将经步骤s3处理后得到的star缺失纯合子雌鱼与野生型雄鱼自然交配。

11、作为本发明的进一步改进，在步骤s3中，所述促性腺激素为人绒毛膜促性腺激素，所述促进star缺失纯合子雌鱼卵母细胞成熟和排卵的制剂为4-孕烷-17α,20β-二醇-3-酮。

12、作为本发明的进一步改进，在步骤s3中，所述处理的方法为：

13、在所述star缺失纯合子雌鱼自然交配前8小时，注射所述人绒毛膜促性腺激素；随后，在所述star缺失纯合子雌鱼自然交配前6小时，使用所述4-孕烷-17α,20β-二醇-3-酮进行药浴处理。

14、作为本发明的进一步改进，在步骤s1中，获得所述star缺失纯合子鱼具体包括如下步骤：

15、s11、利用基因编辑技术敲除鱼类中的star基因，获得f0代；

16、s12、将f0代雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，并对获得的f1代的基因组进行目的检测片段扩增和测序，检测f1代突变情况，获得有效突变的f1代star杂合子鱼；

17、s13、将所述f1代star杂合子鱼进行自交，通过酶切鉴定筛选获得f2代star缺失纯合子鱼。

18、作为本发明的进一步改进，在步骤s11中，所述利用基因编辑技术敲除鱼类中的star基因具体包括如下步骤：

19、p1、基于talens技术，设计鱼类的star基因编辑靶位点；

20、p2、根据所述鱼类的star基因编辑靶位点，设计靶向双臂并组装合成talensmrna；所述靶向双臂包括左臂和右臂；

21、p3、将预定浓度的靶向双臂mrna作为star基因编辑的注射物，进行鱼类受精卵的显微注射。

22、作为本发明的进一步改进，在步骤p1中，所述鱼类的star基因编辑靶位点位于star基因第二个外显子上，以所述star基因第二个外显子上的一个22bpdna序列为中间序列。

23、作为本发明的进一步改进，在步骤p3中，所述预定浓度为50～100ng/μl，所述显微注射时注入的所述star基因编辑的注射物的体积为1.0～2.0nl。

24、为实现上述目的，本发明还提供了上述优化的雌鱼育性控制的方法在水产养殖鱼类遗传育种与生态安全领域中的应用。

25、本发明的有益效果是：

26、1、本发明提供的优化的雌鱼育性控制的方法，通过利用基因编辑技术特异性切割鱼类的star基因，能够获得有效突变的f1代star杂合子鱼，并进行自交，通过酶切鉴定筛选出f2代star缺失纯合子鱼，从而阻断鱼类孕激素的合成，获得的star缺失纯合子鱼中的所有雌鱼由于性腺孕激素合成受阻，其卵母细胞的最终成熟和排卵存在障碍，无法与野生型雄鱼交配产卵，从而获得不育的雌鱼。同时，基于上述方法获得的不育的雌鱼，可以通过使用促性腺激素以及促进star缺失纯合子雌鱼卵母细胞成熟和排卵的制剂进行处理，以使其能够完成自然排卵和受精，并且存活的子代个体在形态上与野生同时期鱼没有明显差异。并且，与单纯使用促进star缺失纯合子雌鱼卵母细胞成熟和排卵的制剂进行处理的方式相比，本发明进一步增加了促性腺激素的使用，能够使处理后的雌鱼的受精率和出膜率显著提高，对雌鱼的育性具有更好的挽救效果。因此，本发明提供的方法不仅能够高效的获得不育的雌鱼，还能够利用促性腺激素与相应制剂有效挽救其育性，从而实现雌鱼育性的控制。

27、2、本发明提供的优化的雌鱼育性控制的方法，能够高效地实现遗传操作雌鱼亲本繁育的人工控制和优化，并可实现其不育子代苗种的可控供应，有效地控制这些遗传操作水产养殖材料的育性，防止人工遗传操作位点在野生型群体中发生漂移造成的“基因污染”，从根本上解决利用新型遗传育种技术进行遗传操作应用的生态安全问题，对于鱼类的遗传操作改良及育种研究的持续发展和推广具有重要意义。同时，也能有效保护经过遗传改良性状的水产品种的知识产权，保障种业科技发展动力，促进水产养殖行业绿色健康的可持续发展。

28、3、star在卵巢中高表达，且与卵母细胞成熟和排卵紧密相关，在鱼类中广泛存在，功能保守。本发明提供的优化的雌鱼育性控制的方法，能够应用于各种水产养殖鱼类中，以实现对水产养殖鱼类中雌鱼育性的有效控制，并保护生态安全，在水产养殖鱼类遗传育种与生态安全领域中具有广阔的应用前景。