甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂性状位点的分子标记及其应用

本发明涉及植物育种领域，具体涉及油菜上卷叶/角果下垂位点及与上卷叶/角果下垂位点的共分离分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81及其应用。

背景技术：

1、甘蓝型油菜是我国国产食用植物油的主要来源，不仅为人类提供食用植物油，还可以作为动物的蛋白饲料(饼粕)以及生物能源的原材料。随着食用植物油消费的不断增长，我国的食用植物油大量依靠进口，因此提高油菜的产量是油菜品种改良最重要的育种目标。株型性状是当前及未来油菜高产育种的关键性状，可以通过遗传改良株叶型和角果形态等株型性状，提高田间种植密度，促进光能利用率，提高作物产量，从而利于油菜产业化。

2、叶片是甘蓝型油菜的主要光合器官，对生长发育至关重要。一些叶片形态性状，包括大小和卷曲程度，显著影响双子叶植物的光合活性和干物质的积累。叶片适度卷曲可以提高光合效率，提高产量。同时也能减少入射太阳辐射和叶片蒸腾作用，从而提供了一定的抗旱性。卷叶性状在油菜生产上，是普遍存在的，但是目前研究报道很少。概念上，油菜的卷叶性状包括：上卷叶、下卷叶和皱型叶。卷叶性状形成的机理多种多样，既包括由各种“激素合成与信号转导缺陷导致卷叶”类机理，也包括“叶型发育相关功能基因突变导致卷叶”类的机理。回顾油菜研究文献，有3篇卷叶性状相关的研究报道。

3、油菜角果既是重要的储存器官，又是重要的光合器官，它具有“库”和“源”的双重作用。油菜植株生长后期及油菜角果的发育成熟期，主要是油菜角果皮在进行光合作用，为种子的生长发育和成熟提供有机物和能量。角果处于植株的冠层，在果轴上呈螺旋形排列，容易接收阳光，并且角果距离种子最近，光合产物供应籽粒极为方便。角果向下垂生性状的形成，会改变光能的利用率并且直接影响到油菜籽粒的干物质积累并最终影响了产量的形成。

4、尽管学者们也对油菜株型育种，作了一些积极的探索，油菜株型育种的发展已经取得了许多成就，但探索新的材料，使油菜具有高产高效的株型，对油菜育种和阐明植物发育机制仍具有重要意义。开发油菜上卷叶/角果下垂新位点的共分离分子标记，可以有助于筛选到高光合效率的油菜品种，提高高产高效油菜选择效率。因此，油菜上卷叶/角果下垂位点的共分离分子标记开发和应用对油菜株型育种具有重要意义，但目前这方面的研究较少。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供位于甘蓝型油菜a05染色体上控制油菜上卷叶/角果下垂性状的新位点及分子标记。甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂性状与这四个分子标记呈极显呈共分离，单株基因型和表型一致，因此这四个分子标记在今后的上卷叶/角果下垂油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景。

2、本发明的另一目的是提供甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂性状新基因位点的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81引物对。

3、本发明的又一个目的是提供甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81或其引物对在检测所述的上卷叶/角果下垂油菜及选育上卷叶/角果下垂油菜品种中的应用。

4、本发明的目的可通过如下技术方案实现：

5、甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记，所述分子标记为indel-72、indel-73、indel-80和indel-81，位于甘蓝型油菜a05染色体上，共分离标记indel-72位于甘蓝型油菜a05染色体上10091788bp-10092026bp，其序列如seq id no.1所示；共分离标记indel-73位于甘蓝型油菜a05染色体上10108957bp-10109136bp，其序列如seq id no.2所示；共分离标记indel-80位于甘蓝型油菜a05染色体上10071497bp-10071698bp，其序列如seq idno.3所示；紧密连锁标记indel-81位于甘蓝型油菜a05染色体上

6、10077849bp-10078041bp，其序列如seq id no.4所示。

7、甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记的引物对，四个共分离分子标记的上游引物序列分别为seq indel-72-f、seq indel-73-f、seq indel-80-f和seq indel-81-f，下游引物序列分别为seq indel-72-r、seq indel-73-r、seq indel-80-r和seq indel-81-r；其中：

8、seq indel-72-f的序列如seq id no.5所示；

9、seq indel-72-r的序列如seq id no.6所示；

10、seq indel-73-f的序列如seq id no.7所示；

11、seq indel-73-r的序列如seq id no.8所示；

12、seq indel-80-f的序列如seq id no.9所示；

13、seq indel-80-r的序列如seq id no.10所示；

14、seq indel-81-f的序列如seq id no.11所示；

15、seq indel-81-r的序列如seq id no.12所示。

16、上述甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记或引物对在上卷叶/角果下垂油菜育种或种质检测中的应用。

17、进一步的，扩增得到239bp、180bp、202bp或193bp条带的为平展叶/角果上冲油菜；扩增得到224bp、188bp、211bp或200bp条带的为上卷叶/角果下垂单株；扩增得到同时具有239bp与224bp、180bp与188bp、202bp与211bp、193bp与200bp条带的为上卷叶/角果下垂杂合体。

18、本发明还提供一种甘蓝型油菜选育方法，利用上述引物对扩增甘蓝型油菜基因组dna，并根据检测结果进行选育；扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，扩增得到239bp、180bp、202bp或193bp条带的为平展叶/角果上冲油菜；扩增得到224bp、188bp、211bp或200bp条带的为上卷叶/角果下垂单株；扩增得到同时具有239bp与224bp、180bp与188bp、202bp与211bp、193bp与200bp条带的为上卷叶/角果下垂杂合体。

19、进一步的，采用ctab法提取甘蓝型油菜单株叶片的基因组dna。

20、进一步的，pcr反应程序为：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。

21、进一步的，pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。

22、进一步的，pcr反应体系包括：0.5uldna模板、上、下游引物各0.25ul、5ul mix，和4ul ddh2o。

23、进一步的，上下游引物的浓度为1mmol/l。

24、一个控制油菜上卷叶/角果下垂位点bnud1，所述bnud1位点位于甘蓝型油菜a05染色体上bnaa05:10055390-10110233bp。所述的共分离标记indel-72位于甘蓝型油菜a05染色体上10091788bp-10092026bp；所述的共分离标记indel-73位于甘蓝型油菜a05染色体上10108957bp-10109136bp；所述的共分离标记indel-80位于甘蓝型油菜a05染色体上10071497bp-10071698bp；所述的共分离标记indel-81位于甘蓝型油菜a05染色体上10077849bp-10078041bp。所述的共分离标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。

25、本发明所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81，这四个共分离的分子标记的上游引物序列分别为seq indel-72-f、seq indel-73-f、seq indel-80-f和seq indel-81-f，下游引物序列分别为seq indel-72-r、seq indel-73-r、seq indel-80-r和seq indel-81-r，seq indel-72-f的序列如seq idno.5所示；

26、seq indel-72-r的序列如seq id no.6所示；

27、seq indel-73-f的序列如seq id no.7所示；

28、seq indel-73-r的序列如seq id no.8所示；

29、seq indel-80-f的序列如seq id no.9所示；

30、seq indel-80-r的序列如seq id no.10所示；

31、seq indel-81-f的序列如seq id no.11所示；

32、seq indel-81-r的序列如seq id no.12所示。

33、其序列为：

34、seq indel-72-f：tctcaaatggaagggaagt(5’-3’)

35、seq indel-72-r：ttgtcggccacattactc(5’-3’)

36、seq indel-73-f：cacaacatgccactaaacc(5’-3’)

37、seq indel-73-r：aagcagaacaaccgaaga(5’-3’)

38、seq indel-80-f：gctccagtggttgttctgt(5’-3’)

39、seq indel-80-r：atcgtctttcgtcgttcata(5’-3’)

40、seq indel-81-f：cacatcaaattaaacaagaat(5’-3’)

41、seq indel-81-r：gaaaccatcatcatcaaca(5’-3’)

42、本发明所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81，在含所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂性状位点的品种和种质检测中的应用。

43、本发明所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81在选育上卷叶/角果下垂油菜品种和种质中的应用。

44、本发明所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81引物对，在含所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂性状位点的品种和种质检测中的应用。

45、本发明所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81引物对在选育上卷叶/角果下垂油菜品种和种质中的应用。

46、一种利用本发明所述分子标记或引物对检测上卷叶/角果下垂甘蓝型油菜的方法，利用本发明所述的引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得亲本njau5773的扩增片段。如果获得亲本njau5773的扩增片段，则表明存在本发明所述的上卷叶/角果下垂油菜。

47、一种利用本发明所述分子标记或引物对选育上卷叶/角果下垂甘蓝型油菜品种的方法，优选用所述indel-72、indel-73、indel-80和indel-81引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得njau5773的扩增片段。如果获得njau5773的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点，预测该油菜是上卷叶/角果下垂油菜。如果获得亲本zs11的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜平展叶/角果上冲位点，预测该油菜是平展叶/角果上冲油菜。

48、本发明甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂基因连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的：

49、(1)遗传群体构建：在自交多代的甘蓝型油菜品系中发现一株上卷叶/角果下垂突变体njau5773，利用njau5773与常规优良品种中双11杂交，得到杂种f1，f1与中双11回交多代，得到bc1-bc6，bc5连续自交分别得到bc5f3，bc6自交得到bc6f2，对f1、bc1-bc6、bc5f3和bc6f2群体单株进行表型调查；

50、(2)甘蓝型油菜bc5f3和bc6f2群体表型测定：对上述bc5f3和bc6f2群体中共1042个单株进行表型观察以及农艺性状调查；

51、(3)bsa-seq分析：选择bc6f2群体中的30个上卷叶/角果下垂单株和30个平展叶/角果上冲单株，作bsa混池测序分析。bsa-seq分析结果将上卷叶/角果下垂位点定位于a05染色体上的7094487-11086188bp的区段内。

52、(4)利用油菜a05染色体7094487-11086188bp区段内的indel信息，设计分子标记；

53、(5)根据bc5f3和bc6f2群体表型数据和分子标记数据，发现共分离共显性分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81，而且其遗传带型清晰可见。

54、有益效果

55、本发明在国际上首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜a05染色体10055390-10110233bp区域内控制甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点，同时发现与上卷叶/角果下垂位点共分离的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81，这些分子标记在f2、bc1-bc6、bc5f3和bc6f2群体中的表型与基因的一致性，使其在甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂育种中具有非常重要的价值。

56、1、首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜a05染色体10055390-10110233bp区域内控制甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂位点，同时发现与上卷叶/角果下垂位点共分离的分子标记indel-72、indel-73、indel-80和indel-81；

57、2、在f2、bc1-bc6、bc5f3和bc6f2群体中，甘蓝型油菜上卷叶/角果下垂性状与这四个分子标记呈共分离，单株基因型和表型一致，因此这四个分子标记在今后的上卷叶/角果下垂油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景；

58、3、本发明能够在甘蓝型油菜中找到纯合上卷叶/角果下垂油菜，对上卷叶/角果下垂株型育种有很大帮助。