氟西汀半抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

本发明属于食品安全免疫检测领域，具体涉及氟西汀半抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

背景技术：

1、氟西汀是第一个上市的5-ht再摄取抑制剂类抗抑郁药物，作用于中枢神经系统，除了常用于治疗抑郁症，氟西汀也可以治疗强迫症、惊恐障碍、创伤后应激障碍(ptsd)等；它疗效确切，副反应较轻，市场发展很快。因其能选择性地抑制通过5-羟色胺转运体，并阻断突触前膜对5-羟色胺的再摄取，它能治疗抑郁的同时还具有治疗神经性贪食症的作用，因此食用氟西汀能抑制食欲。2017版神经精神药理学与药物精神病协会(agnp)的精神科治疗药物监测共识指南推荐氟西汀最低质量浓度的治疗窗为60ng/ml，总质量浓度的治疗窗120-500ng/ml，因此在药品、减肥产品中对氟西汀的检测，建立氟西汀的检测方法，具有重要意义。

2、目前相关技术中，对氟西汀的检测多以仪器方法分析为主，虽然该方法具有较高的准确性和灵敏度，但成本高、对检测环境和技术人员的要求高等特点限制了其发展。近年来免疫分析技术的快速发展，建立一种针对氟西汀的高效、快速的免疫检测方法成为可能，包括酶联免疫法(elisa)、胶体金免疫层析试纸条技术和免疫磁珠技术等。而这些方法建立的一个重要前提即需筛选出针对氟西汀的高特异性单克隆单体，其中人工抗原的合成是其中重要的一步；将得到的完全抗原免疫小鼠后，如何筛选得到抑制较好的阳性小鼠，小鼠脾细胞和瘤细胞融合得到杂交瘤细胞株，还需进一步的研究；如何使得氟西汀单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

技术实现思路

1、为解决相关技术中存在的问题，本发明提供一种氟西汀人工抗原的制备方法，该制备过程更为简洁高效，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原；并且提供一株分泌氟西汀单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并应用于氟西汀免疫分析方法研究，由该杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体对氟西汀具有良好的特异性和检测灵敏度，可以用来建立氟西汀的免疫学检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，为间接竞争elisa试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。

2、本发明提供一种氟西汀半抗原的制备方法，由氟西汀与4-溴丁酸乙酯反应，得到半抗原中间体；再将所述半抗原中间体在碱性条件下水解反应，调整ph至酸性，得到沉淀，经离心烘干得到氟西汀半抗原fxt-h，反应式如下：

3、

4、由氟西汀经过与4-溴丁酸乙酯在原结构上加上了一个连接臂，使得整体结构可以暴露羧基基团的产物，即半抗原fxt-h。

5、根据本发明，提供一种氟西汀完全抗原，由所述的氟西汀半抗原与载体蛋白偶联获得，即用碳二亚胺法将半抗原fxt-h与载体蛋白偶联，得到氟西汀人工抗原。

6、根据本发明，利用所述氟西汀完全抗原免疫小鼠可以获得一种氟西汀单克隆抗体。

7、本发明还提供一株分泌所述氟西汀单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过免疫小鼠，细胞融合的方法获得，该杂交瘤细胞株已于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株ymz，保藏编号为cgmccno.45124，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

8、根据本发明，将氟西汀人工抗原应用于检测分析样品中的氟西汀含量，用于制备氟西汀免疫检测试剂盒，或用于制备氟西汀检测胶体金试纸条。

9、根据本发明，将氟西汀完全抗原用于检测分析样品中的氟西汀含量，用于制备氟西汀免疫检测试剂盒，或用于制备氟西汀检测胶体金试纸条。

10、根据本发明，提供一种试剂盒或者胶体金试纸条，含有所述的氟西汀单克隆抗体。

11、根据本发明，所述的试剂盒或者胶体金试纸条应用于检测分析药品、减肥产品中氟西汀的含量。

12、本发明提供的分泌氟西汀单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备基本步骤为：

13、(1)完全抗原的制备与鉴定：将上述合成的半抗原fxt-h，通过与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定，得到完全抗原；

14、(2)小鼠的免疫：选取6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。将完全抗原(fxt-h-bsa)与弗氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠(冲刺免疫除外)，首次免疫采用弗氏完全佐剂，多次加强免疫使用弗氏不完全佐剂，剂量减半；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，冲刺免疫时免疫剂量为多次加强免疫剂量的一半。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；三免之后，每次加强免疫的第7天通过尾部采血，用间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)对小鼠免疫效果进行检测，其中包被完全抗原为fxt-h-ova；

15、(3)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(peg 4000)法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过选择性培养基(hat培养基)培养，融合一周后，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有较好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得针对氟西汀分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

16、(4)杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；通过elisa法测定ic50值、交叉反应率。

17、与相关技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

18、本发明提供的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，针对药品、减肥产品中的氟西汀较好的检测灵敏度和亲和力；可实现氟西汀含量的检测。对氟西汀的ic50值为1ng/ml，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的氟西汀的检测方法提供了新手段，具有实际应用价值。

19、生物材料保藏

20、一株分泌氟西汀单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为：单克隆细胞株ymz，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.45124，保藏日期为：2022年03月03日。

技术特征：

1.一种氟西汀半抗原的制备方法，其特征在于，由氟西汀与4-溴丁酸乙酯反应，得到半抗原中间体；再将所述半抗原中间体在碱性条件下水解反应，调整ph至酸性，得到沉淀，经离心烘干得到氟西汀半抗原，反应式如下：

2.一种氟西汀半抗原，其特征在于，由权利要求1所述的方法制备而成。

3.一种氟西汀完全抗原，其特征在于，由权利要求2所述的氟西汀半抗原与载体蛋白偶联获得。

4.一种氟西汀单克隆抗体，其特征在于，由权利要求3所述的氟西汀完全抗原免疫小鼠获得。

5.一株分泌权利要求4所述的氟西汀单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株ymz，保藏编号为cgmcc no.45124，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

6.如权利要求3所述的氟西汀完全抗原在检测分析氟西汀含量中的应用、在制备氟西汀免疫检测试剂盒中的应用或在制备氟西汀检测胶体金试纸条中的应用。

7.如权利要求4所述的氟西汀单克隆抗体在检测分析氟西汀含量中的应用、在制备氟西汀免疫检测试剂盒中的应用或在制备氟西汀检测胶体金试纸条中的应用。

8.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的氟西汀单克隆抗体。

9.一种胶体金试纸条，其特征在于，含有权利要求4所述的氟西汀单克隆抗体。

10.权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的胶体金试纸应用于检测分析药品、减肥产品中氟西汀的含量。

技术总结
本发明公开了一种氟西汀半抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明提供的氟西汀人工抗原的制备方法，该制备过程更为简洁高效，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原；并且提供一株分泌氟西汀单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并应用于氟西汀免疫分析方法研究，由该杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体对氟西汀具有良好的特异性和检测灵敏度，对氟西汀的IC50达到1ng/mL，可以用来建立氟西汀的免疫学检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。

技术研发人员：匡华,李小玲,胥传来,徐丽广,孙茂忠,吴晓玲,刘丽强,郝昌龙,宋珊珊,胡拥明,吴爱红,郭玲玲,胥欣欣
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13