肠上皮类器官及基因修饰肠上皮类器官的构建方法

本发明涉及肠上皮类器官培养相关技术，具体涉及一种肠上皮基因修饰类器官培养方法。

背景技术：

1、肠上皮类器官的出现极大地促进了对消化系统正常发育和生理学以及消化系统疾病发病机制的理解。

2、随着基因工程技术的发展，基因修饰肠上皮类器官正在被探索作为永生化细胞系和基因工程动物的潜在替代品。然而，现有肠上皮类器官的基因操作耗时、繁琐，且形成有效的同质基因修饰类器官的效率远远不能令人满意，限制基因递送效率的两个主要障碍是三维培养条件和在细胞悬浮条件中进行的基因传递。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷或不足，本发明一方面提供了一种肠上皮类器官构建方法。

2、为此，本发明提供的肠上皮类器官构建方法包括：

3、步骤1，分离肠隐窝；

4、步骤2，培养肠隐窝，获得原代单层肠上皮细胞；

5、步骤3，用重组胰蛋白酶对原代单层肠上皮细胞进行消化，得到消化后的细胞；

6、步骤4，利用基质胶对消化后的细胞重悬后进行培养，获得肠上皮类器官。

7、本发明还提供了一种基因修饰肠上皮类器官构建方法。为此，本发明所提供的基因修饰肠上皮类器官构建方法包括：

8、步骤一，分离肠隐窝；

9、步骤二，培养肠隐窝，培养过程中向培养体系中加入感染体系进行感染，获得基因修饰原代单层肠上皮细胞；所述感染体系包括慢病毒；

10、步骤三，用重组胰蛋白酶对基因修饰原代单层肠上皮细胞进行消化，得到消化后的细胞；

11、步骤四，利用基质胶对消化后的细胞重悬后进行培养，获得基因修饰肠上皮类器官。

12、可选方案中，所述感染体系包括慢病毒和培养液，所述培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自rock抑制剂、egf、wnt3a、noggin和r-spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自dmem/f12培养液或intesticult类器官培养液。

13、可选的方案是，本发明相应步骤培养过程中用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自rock抑制剂、egf、wnt3a、noggin和r-spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自dmem/f12培养液或intesticult类器官培养液。

14、本发明的方法培养时间短，且可获得的大量肠上皮类器官构建方法及基因修饰肠上皮类器官。

技术特征：

1.一种肠上皮类器官构建方法，其特征在于，方法包括：

2.根据权利要求1所述的肠上皮类器官构建方法，其特征在于，步骤2培养用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自rock抑制剂、egf、wnt3a、noggin和r-spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自dmem/f12培养液或intesticult类器官培养液。

3.根据权利要求1所述的肠上皮类器官构建方法，其特征在于，步骤4培养用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自rock抑制剂、egf、wnt3a、noggin和r-spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自dmem/f12培养液或intesticult类器官培养液。

4.一种基因修饰肠上皮类器官构建方法，其特征在于，方法包括：

5.根据权利要求4所述的基因修饰肠上皮类器官构建方法，其特征在于，所述感染体系包括慢病毒和培养液，所述培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自rock抑制剂、egf、wnt3a、noggin和r-spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自dmem/f12培养液或intesticult类器官培养液。

6.根据权利要求4所述的基因修饰肠上皮类器官构建方法，其特征在于，步骤二培养用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自rock抑制剂、egf、wnt3a、noggin和r-spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自dmem/f12培养液或intesticult类器官培养液。

7.根据权利要求4所述的基因修饰肠上皮类器官构建方法，其特征在于，步骤四培养用培养液为含生长因子的基础培养液，所述生长因子选自rock抑制剂、egf、wnt3a、noggin和r-spondin中的一种或两种以上的组合；所述基础培养液选自dmem/f12培养液或intesticult类器官培养液。

技术总结
本发明涉及肠上皮类器官培养相关技术，具体涉及一种肠上皮类器官及基因修饰肠上皮类器官构建方法。所述肠上皮类器官构建方法包括：步骤1，分类肠隐窝；步骤2，培养肠隐窝，获得单层肠原代细胞；步骤3，用重组胰蛋白酶对单层肠原代细胞进行消化，得到消化后的细胞；步骤4，利用基质胶对消化后的细胞进行重悬后进行培养，获得肠上皮类器官。所述基因修饰肠上皮类器官构建方法是在上述方法基础上在步骤2培养过程中感染慢病毒颗粒。本发明的方法培养时间短，且可获得的大量肠上皮类器官及基因修饰肠上皮类器官。

技术研发人员：董加强,聂勇战,吴开春,韩渭丽,王睿,赵晟,陶海强
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11