一种重组酵母菌株及其在生物转化人参二醇型皂苷中的应用

本发明涉及一种重组酵母菌株及其在生物转化人参二醇型皂苷中的应用，属于基因工程。

背景技术：

1、长期以来，人参一直是世界各地高度重视的药草，可保持身体活力和延年益寿。据广泛报道，人参中的主要活性成分是人参皂甙，在抗癌、抗炎和抗氧化研究等方面有很大的应用。人参皂苷可大致分为齐墩果烷型人参皂苷(ro等)、原人参二醇型人参皂苷(rb1、rb2、rb3、rc、rd、f2、ck等)和原人参三醇型人参皂苷(re和rf)。另外，根据去糖基化程度，人参皂苷可分为主要人参皂苷和次要人参皂苷。次要人参皂苷是通过主要人参皂苷的去糖基化获得的，在天然人参植物中不存在或非常低。此外，次要人参皂苷(f2和ck等)具有更高的生物利用度，因为它们的分子量更小，并且比主要人参皂苷具有更好的膜渗透性。目前，含有ck的片剂可作为类风湿性关节炎候选药物。

2、许多先前的研究都集中在使用热处理、酸碱处理或酶催化将主要人参皂苷转化为次要人参皂苷。其中，加热或酸碱处理方法对糖苷键的水解是随机的，导致产品达不到预期的药理活性。而过度的能源消耗和废物也对环境造成了严重的污染。高选择性的酶催化策略在绿色生产稀有人参皂苷方面比物理或化学制备方法具有显着优势。新型生物催化剂在绿色化学和可持续化学工程中占有重要地位，有望克服现有生物催化剂的不足。据报道，来自塔宾曲霉的胞外酶是第一个可以将原二醇性主要人参皂苷完全转化为ck的gras酶。同样，我们前期筛选了一个菌株a.tubingensis je0609可以有效地将原二醇性主要人参皂苷生物转化为ck。很明显，塔宾曲霉是一种非常有价值的工业真菌，用于稀有人参皂苷的制备和天然化合物的高价值转化。据文献报道，能水解原二醇性主要人参皂苷的糖苷酶多为β-葡萄糖苷酶。因此，在人参皂苷生物转化过程中鉴定相关β-葡萄糖苷酶是发现新型高效生物催化剂和合理指导人参皂苷催化生产的关键和基础步骤。

技术实现思路

1、本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母过表达了塔宾曲霉(aspergillus tubingensis)来源的β-葡萄糖苷酶β-gc，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq id no.1所示(命名为β-gc1)或seq id no.3所示(命名为β-gc2)。

2、在本发明的一种实施方式中，编码所述β-葡萄糖苷酶β-gc1的核苷酸序列如seqid no.2所示；

3、在本发明的一种实施方式中，编码所述β-葡萄糖苷酶β-gc2的核苷酸序列如seqid no.4所示。

4、在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以ppic9k为表达载体。

5、在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以毕赤酵母gs115为表达宿主。

6、本发明还提供了一种重组塔宾曲霉β-葡萄糖苷酶的高效分泌表达方法，其主要步骤为：首先提取塔宾曲霉的rna，将其反转录cdna。以塔宾曲霉cdna为模板从中采用pcr的方法扩增得到β-葡萄糖苷酶基因，克隆到毕赤酵母的表达载体ppic9k上，经电转化法将重组的基因导入毕赤酵母(pichia pastoris)宿主菌gs115中，经甲醇诱导表达获得β-葡萄糖苷酶。

7、在本发明的一种实施方式中，本发明所述的编码产生的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列为seq id no.1中的氨基酸构成的蛋白序列；重组基因同时引入了ecori和noti酶切位点，确保目的蛋白的天然n端完整性，不引入纯化标签序列等额外氨基酸残基。所述的表达载体为毕赤酵母/大肠穿梭质粒ppic9k；所述宿主细胞为毕赤酵母gs115；所述的重组质粒电转入毕赤酵母宿主细胞前，需用saci限制性内切酶进行线性化处理，与宿主细胞在aox1基因处重组，利用载体ppic9k的醇氧化酶强启动子(aox)进行外源蛋白的高效分泌表达。

8、在本发明的一种实施方式中，以塔宾曲霉cdna为模板，设计扩增引物，引物为f：5’-gctgaagcttacgtagaattccaaagcaacgcaagctctttcg-3’和r：5’-aaggcgaattaattcgcggccgcttgaccgttcaagaacactggtgg-3’，其中下划线为同源臂序列，然后pcr扩增得到重组β-葡萄糖苷酶基因(不带信号肽序列)，通过同源重组将β-葡萄糖苷酶基因克隆到毕赤酵母的表达载体ppic9k(购自invitrogen公司)，得到重组表达质粒ppic9k-β-葡萄糖苷酶。

9、在本发明的一种实施方式中，saci线性化重组表达质粒后，电转化至毕赤酵母宿主细胞gs115(购自invitrogen公司)，电转化的具体参数为：2mm转化杯，1500v电压，200ω电阻，25uf电容，md平板筛选后，酵母菌落pcr进行验证，具体过程参照invitrogen公司毕赤酵母操作手册，确保β-葡萄糖苷酶已与宿主细胞在aox1基因处重组，以载体ppic9k醇氧化酶强启动子(aox)进行高效表达。挑取阳性克隆子参照上述手册，在三角烧瓶以0.5％甲醇进行诱导表达，96h后离心收集上清，以pnpg法进行活性测定，上清中即得到重组β-葡萄糖苷酶。

10、本发明提供了一种制备人参皂苷rd的方法，所述方法为，将所述的重组毕赤酵母或采用所述重组毕赤酵母发酵制备的β-葡萄糖苷酶β-gc1或β-葡萄糖苷酶β-gc2添加至含有人参皂苷rb1、人参皂苷rc、人参皂苷rb2和/或人参皂苷rb3的反应体系中进行反应，制备得到人参皂苷rd。

11、在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶β-gc1或β-葡萄糖苷酶β-gc2的添加量为400u/ml。

12、在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的底物为人参皂苷混合液，所述人参皂苷混合液是将人参皂苷rb1、人参皂苷rc、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3添加的浓度比为2：1：1：1的比例进行混合后制备得到的；所述底物溶液的总浓度为5mg/ml。

13、在本发明的一种实施方式中，所述反应的条件为：ph 5.5～6.0，45～55℃反应4～9h。

14、在本发明的一种实施方式中，反应条件为ph 6.0、50℃反应6h。

15、本发明还提供了一种制备人参皂苷ck的方法，所述方法为，将上述表达氨基酸序列如seq id no.1所示β-葡萄糖苷酶的重组毕赤酵母，或将氨基酸序列如seq id no.1所示的β-葡萄糖苷酶β-gc1添加至反应体系中进行反应，制备得到人参皂苷ck；

16、所述反应体系中含有人参皂苷rb1、rc、rb2和/或rb3、乳糖酶酶液；

17、或所述反应体系中含有人参皂苷f2。

18、在本发明的一种实施方式中，所述人参皂苷f2添加的浓度为：2mg/ml。

19、在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶β-gc1的添加量为400u/ml。

20、在本发明的一种实施方式中，所述乳糖酶酶液的添加量为170u/ml。

21、在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的底物为人参皂苷混合液，所述人参皂苷混合液是将人参皂苷rb1、人参皂苷rc、人参皂苷rb2、人参皂苷rb3按照浓度比为2：1：1：1的比例进行混合后制备得到的；所述底物溶液的总浓度为5mg/ml。

22、在本发明的一种实施方式中，所述反应的条件为：ph 5.5～6.0，45～55℃反应4～9h。

23、在本发明的一种实施方式中，反应条件为ph 6.0、50℃反应6h。

24、本发明还提供了上述重组毕赤酵母或上述β-葡萄糖苷酶β-gc1或上述β-葡萄糖苷酶β-gc2在水解人参皂苷rb1、人参皂苷rc、人参皂苷rb2和/或人参皂苷rb3中的应用。

25、在本发明的一种实施方式中，编码所述β-葡萄糖苷酶β-gc2的核苷酸序列如seqid no.4所示。

26、在本发明的一种实施方式中，编码所述β-葡萄糖苷酶β-gc1的核苷酸序列如seqid no.2所示。

27、有益效果

28、(1)重组塔宾曲霉(aspergillus tubingensis)来源的β-葡萄糖苷酶β-gc1在毕赤酵母中高效分泌表达，而且这种重组β-葡萄糖苷酶可用于高效水解原二醇性主要人参皂苷制备稀有人参皂苷ck。

29、(2)本发明的重组β-葡萄糖苷酶β-gc1酶活可达235.73u/ml，能高效水解人参皂苷rb1、rc、rb2和rb3获得rd；重组β-葡萄糖苷酶又可水解人参皂苷f2获得ck。

30、(3)重组塔宾曲霉(aspergillus tubingensis)来源的β-葡萄糖苷酶β-gc2在毕赤酵母中高效分泌表达，而且这种重组β-葡萄糖苷酶可用于高效水解原二醇性主要人参皂苷制备人参皂苷rd。

31、(4)本发明的重组β-葡萄糖苷酶β-gc2酶活可达59.41u/ml，能高效水解人参皂苷rb1、rc、rb2和rb3获得rd。

32、(5)重组β-葡萄糖苷酶β-gc1可水解制备ck，其他的重组的塔宾曲霉(aspergillustubingensis)来源的β-葡萄糖苷酶β-gc2不能用于制备ck。

33、本发明制备的β-葡萄糖苷酶β-gc1具有潜在的生产稀有人参皂苷工业的应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。