重组抗体的表达载体及其表达感兴趣重组抗体的制备方法与流程

本发明属于生物工程，具体为重组抗体的表达载体及其表达感兴趣重组抗体的制备方法。

背景技术：

1、传统的抗体技术主要包括兔多抗技术以及小鼠杂交瘤技术，其主要弊端在于制备过程依赖动物，不仅无法克服动物个体差异性带来的批间差，而且随着人类对动物保护的认识加强，强制性不使用动物用于制备抗体也将是大势所趋。新一代重组抗体技术与传统杂交瘤技术相比有二个明显优势，一是可根本防止杂交瘤细胞容易丢失的缺陷，从而真正达到抗体的“永生化”。另外，可从根本上摆脱动物依赖性，从而防止了因动物批次差异导致的批间差异，保证了产品的“稳定性及一致性”，特别适用于大剂量单抗的工业化使用。

2、完整抗体的基本结构为两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。重链和轻链通过二硫键和非共价相互作用结合在一起。链本身包括可变区和恒定区，重链和轻链的可变区位于抗体分子的n-末端部分，其氨基酸序列比恒定区更易发生变化。重组抗体的生产是通过分子生物学的手段，将抗体中的重链基因片段和轻链基因片段导入到宿主细胞中进行蛋白的表达及组装后，通过纯化等一系列技术手段获得。

3、与重组蛋白的高产表达相似，比如设计带有强启动子的最佳表达盒的表达载体，采用有效的高密度悬浮细胞—中国仓鼠卵巢(cho)细胞的哺乳动物表达系统，优化培养基，培养条件等，都可以提高最终产物产量。重组抗体与重组蛋白表达的最重要区别在于，重组抗体在哺乳动物细胞中表达的轻链蛋白与重链蛋白的比例对重组抗体的最终产量有重要影响。因此，设计高产量的重组抗体表达载体是重组抗体表达技术的关键环节。目前常规的方法，两个独立的哺乳动物表达系统的表达载体分别装载重组抗体的重链和轻链基因片段，通过共转染这两个表达载体最终获得完整的抗体产品；或者是同一哺乳动物表达系统的表达载体采用两个独立的表达盒装载重链蛋白和轻链蛋白，转染该质粒后获得最终产品。这些方法一方面是增加上游分子构建及表达过程的工作难度，另一方面是重链和轻链的rna转录水平不可控，存在装配比例不合适，装配功能型重组抗体比例降低，最终导致重组抗体产量降低的问题。本发明提供的一种表达重组抗体的单质粒表达载体，采用一个表达盒同时表达重链和轻链，降低分子构建和细胞转染难度，同时也保证了重链和轻链的rna转录水平的一致性。实验结果表明，利用该载体装载公布的rituximab，trastuzumab，muromonab-cd3抗体序列，比常规双质粒表达载体构建简单，并且能有效提高重组抗体的表达产量。

技术实现思路

1、针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了重组抗体的表达载体及其表达感兴趣重组抗体的制备方法。

2、本发明提供如下的技术方案：本发明提出了一种重组抗体的表达载体，具体为含突变型hcmv启动子、chimeric intron、wpre-bgh polya终止子的表达元件的表达载体pdai。

3、同时，本发明还提出了一种重组抗体的表达载体表达感兴趣重组抗体的制备方法，具体包括下列步骤：

4、(1)表达载体pdai的构建

5、将序列信息进行序列优化设计化学合成含突变型hcmv启动子和chimeric intron的基因序列(hcmv(m)-chimeric intron)，化学合成wpre和bgh polya终止子的基因序列(wpre-bgh polya)，并通过同源重组的方法连接到保留复制子和抗性基因的pcdna3.1载体(酶切位点mlu i/bbs i)骨架上；

6、引物序列：

7、f1：5‘-cgggccagatatacgcgttacattgattattgactagttatt-3’

8、f2：5‘-tccacaggtgtccagcggatccgaattctcgaaatcaacctct-3’

9、r1：5‘-agaggttgatttcgagaattcggatccgctggacacctgtgga-3’

10、r2：5‘-atccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctc-3’

11、第一轮pcr扩增体系(总体系50ul)：

12、

13、反应条件为：95℃预变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s，30个循环，16℃保持；扩增出含hcmv(m)-chimeric intron的p1片段；同样的条件，更换上下游引物为f2，r2，扩增出含wpre-bgh polya的p2片段；

14、第二轮pcr扩增体系(总体系50ul)：

15、

16、

17、反应条件为：95℃预变性10s，65℃退火5s，72℃延伸20s，30个循环，16℃保持；

18、将第二轮pcr产物克隆到酶切位点为mlu i/bbs i的pcdna3.1载体上，构建成表达载体pdai，经跑胶和测序验证，载体构建成功；

19、(2)表达载体rituximab-pdai，trastuzumab-pdai，muromonab-cd3-pdai的构建

20、化学合成含kozak序列，感兴趣抗体轻链，p2a和感兴趣抗体重链的基因序列，并通过酶切酶连的方法连接到表达载体pdai上(克隆位点bamhi/ecori)，经跑胶和测序验证，载体构建成功；

21、(3)重组抗体表达质粒rituximab-pdai，trastuzumab-pdai，muromonab-cd3-pdai的提取和cho细胞转染，其他表达质粒转染步骤类似

22、提取：使用life质粒dna中提试剂盒，按照操作手册接菌10ml，提取完成的质粒取2μl用核酸测定仪(nanodrop one)测浓度，取3μl跑胶电泳检测验证，提取出的质粒-20℃保存；

23、cho细胞转染：

24、转染前一天取细胞计数，0.5×106/ml×30ml传到一个新的125ml摇瓶中。若细胞聚集成团，计数前需要用细胞筛网过滤；转染当天，准备2个2ml离心管，分别加入0.8ml无血清培养基；一管加30μg质粒，另一管加60μg pei，轻柔的翻转离心管几次混合均匀；将稀释后的pei加入稀释的质粒中，轻柔的翻转离心管几次混合均匀后，室温孵育15min；将混合物慢慢加到准备好的30ml细胞中，边加边摇晃，完成转染；继续培养到第6天收样；

25、(4)表达质粒rituximab-pdai，trastuzumab-pdai，muromonab-cd3-pdai的产物纯化以及与其他双质粒表达载体表达量的比较

26、取转染后的培养液离心，上清用0.22um膜过滤，在4℃环境下透析至含有150mmol/ml nacl、ph＝7.0、且浓度20mmol/ml的na2hpo4缓冲液中，透析结束后再用proteina柱纯化，得到重组抗体蛋白。

27、进一步地，所述hcmv(m)-chimeric intron的核苷酸序列为：

28、acattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatggggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggccagcggtttagtgaaccgtcagatcctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccag。

29、进一步地，所述wpre-bgh polya的核苷酸序列为：

30、aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgtctagacgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg。

31、进一步地，所述rituximab-pdai的核苷酸序列为：

32、gccgccaccatggtcctccagacccaggtgttcatcagtctgctgctgtggattagcggcgcctacggccagatcgtgctgagccagagccccgccatcctgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatccactggttccagcagaagcccggcagcagccccaagccctggatctacgccaccagcaacctggccagcggcgtgcccgtgcgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagccgcgtggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggaccagcaacccccccaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgcaccgtggccgcccccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgagcagccccgtgaccaagagcttcaaccgcggcgagtgcggaagcggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatgaagcacctgtggttctttctgctgctcgtggctgctcccagatgggtcctgagccaggtgcagctgcagcagcccggcgccgagctggtgaagcccggcgccagcgtgaagatgagctgcaaggccagcggctacaccttcaccagctacaacatgcactgggtgaagcagacccccggccgcggcctggagtggatcggcgccatctaccccggcaacggcgacaccagctacaaccagaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgcagcacctactacggcggcgactggtacttcaacgtgtggggcgccggcaccaccgtgaccgtgagcgccgccagcaccaagggccccagcgtgttccccctggcccccagcagcaagagcaccagcggcggcaccgccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggccgagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgagctgctgggcggccccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccgcacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagccccgcgaggagcagtacaacagcacctaccgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccccagccgcgacgagctgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagccgctggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgagccccggcaag。

33、进一步地，所述trastuzumab-pdai的核苷酸序列为：

34、gccgccaccatggtcctccagacccaggtgttcatcagtctgctgctgtggattagcggcgcctacggcgacatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccaggacgtgaacaccgccgtggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacagcgccagcttcctgtacagcggcgtgcccagccgcttcagcggcagccgcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagcactacaccaccccccccaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagcgcaccgtggccgcccccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgagcagccccgtgaccaagagcttcaaccgcggcgagtgcggaagcggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatgaagcacctgtggttctttctgctgctcgtggctgctcccagatgggtcctgagcgaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaacatcaaggacacctacatccactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggcccgcatctaccccaccaacggctacacccgctacgccgacagcgtgaagggccgcttcaccatcagcgccgacaccagcaagaacaccgcctacctgcagatgaacagcctgcgcgccgaggacaccgccgtgtactactgcagccgctggggcggcgacggcttctacgccatggactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaagggccccagcgtgttccccctggcccccagcagcaagagcaccagcggcggcaccgccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgagctgctgggcggccccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccgcacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagccccgcgaggagcagtacaacagcacctaccgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccccagccgcgaggagatgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagccgctggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgagccccggcaag。

35、进一步地，所述muromonab-cd3-pdai的核苷酸序列为：

36、gccgccaccatggtcctccagacccaggtgttcatcagtctgctgctgtggattagcggcgcctacggccagatcgttctgacacagagccccgctatcatgagcgcttccccaggcgagaaggtgaccatgacctgtagcgcctctagcagcgtgtcttacatgaactggtaccagcaaaagagcggcacaagccctaaaagatggatctacgacacctctaaactggccagcggagtgcctgcccacttccggggcagcggcagcggcacctcttatagcctgaccatcagcggtatggaagctgaagatgccgccacctactactgccagcaatggtccagcaacccttttaccttcggcagcggcacaaagctggaaatcaatagagccgatacagcccctaccgtgtccatcttccctcccagcagcgagcagctgacatctggaggcgccagcgtggtgtgcttcctgaacaacttctaccccaaggacatcaacgtgaagtggaagatcgacggctctgaaagacagaacggcgtgctgaatagctggacagatcaggacagcaaggactctacatacagcatgtccagcaccctgaccctgaccaaggacgagtacgagcggcacaacagctacacctgcgaggccacacacaagaccagcacctcccctatcgtgaaatcttttaacagaaacgagtgcggaagcggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatgaagcacctgtggttctttctgctgctcgtggctgctcccagatgggtcctgagccaggtgcagctgcaacaaagcggcgccgagctggctagacctggcgcttctgtgaagatgagctgtaaagccagcggctatacctttaccaggtataccatgcactgggtgaagcagcggcctggccagggcctggaatggatcggctacatcaaccccagccggggctacacaaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccactgataagagctcttctacagcctacatgcagctgtcttctctgacaagcgaggacagcgccgtgtactactgcgccagatactacgacgaccactattgtctggattactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgctagcgcaaagacgaccgcccccagcgtgtaccctctggcccctgtgtgcggaggcaccacaggcagctccgtgacactgggctgtctggtgaaaggctacttccctgaacccgtgaccctgacctggaacagcggtagcctgtcctccggagttcatacattccccgccgtgctgcagagcgatctgtacacactgagcagctctgtgaccgtgaccagcagcacatggcctagccagagcattacatgcaacgtggcccaccccgccagcagcaccaaggtggacaaaaagatcgagcccagaccaaagagctgcgacaaaacacacacctgccctccttgccccgccccagaactgctggggggcccttctgtgttcctgtttccacctaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaggtgacctgcgtggtggtcgacgtgagccatgaggaccctgaggtgaaattcaactggtacgtggacggcgtggaagtccacaacgccaagacaaagccccgggaagagcagtacaatagcacctacagagtggtgtctgtcctgaccgttctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccctatcgagaagacaatctccaaagccaagggccagcctagagagccccaggtgtacaccctgcctccttcccgcgacgagctgacaaagaaccaggtgtccctcacctgtctggtgaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggaatgggagagcaacggacaacctgaaaacaactacaagaccacccctccagtgctggactccgatggctccttcttcctctacagcaagctgaccgtggataagtctcggtggcagcagggaaatgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaatcactatacccagaaatctctgagcctgtcacctggaaagtaagaattc。

37、采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的重组抗体的表达载体及其表达感兴趣重组抗体的制备方法，提供了一种含突变型hcmv启动子，chimeric intron，wpre，bghpolya终止子的表达元件的表达载体pdai，及采用连接抗体轻链和重链的p2a序列，用pdai制备感兴趣重组抗体表达载体的方法；通过构建感兴趣重组抗体(rituximab，trastuzumab，muromonab-cd3)表达载体说明，该表达载体构建过程简单，并且能有效提升抗体表达量；其制备过程简单，能够稳定有效的在哺乳动物细胞中表达重组抗体，通用性强，而且重组抗体表达产量高。