一种逆转菌体耐药的通用型抗菌药物及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种逆转菌体耐药的通用型抗菌药物及其应用。

背景技术：

1、传统抗生素是天然的、合成的或半合成的具有抗菌活性的化合物分子，能够有效控制细菌感染。但随着传统抗生素的滥用与细菌适应，细菌产生耐药机制，包括但不限于改变被作用靶标、改变膜通透性、产生灭活酶等。耐药性问题在医院、养殖场等场所日益严重，已对全球公共卫生与环境安全构成重大威胁。

2、虽然研究者努力开发新的抗生素化合物分子，但开发新抗生素的速度与细菌产生抗药性的速度相比，慢得多。依赖于先进的测序技术，各种类型的细菌基因组核酸序列都能被快速测出，直攻致病菌的根本--“基因组遗传物质”，可以釜底抽薪、一劳永逸，是一种新型抗菌药物研发的新方向。

3、目前，crispr/cas系统已经被应用于攻击细菌核酸遗传物质，它能通过靶向破坏耐药基因，使细菌恢复对抗生素的敏感致其死亡，限制有害基因在微生物间的转移和流行。但是，基于crispr/cas系统研发攻击细菌核酸的抗菌药物，仍有难以解决的问题：(1)靶向基因组dna的cas9或cas12蛋白体积大，蛋白本身甚至可达200kda，编码mrna长达4000-nt以上，制药工艺复杂，递送难度大，不利于体内用药安全；(2)靶向mrna的cas13蛋白的附带切割效应，会加剧脱靶等问题，不利于用药安全；(3)锚定过程受限于固定的碱基搭配模式(pam/pfs序列)，无法实现攻击细菌核酸物质的任意位点；(4)与crispr相关的专利权几乎都掌握在国外公司及专家手中，这对我们国内研发推广基于crispr系统的各种药物及产品是极为不利的。

4、因此，本项目将针对以上问题，开发一种在原核细胞中工作的、小体积、无序列偏爱性、特异性较强的，基于攻击细菌核酸遗传物质的抗菌药物antib-sgn，通过靶向耐药基因，逆转菌体耐药从而杀死细菌。我们假设antib-sgn的这种概念验证逆菌体转耐药策略具有潜在的临床价值，可针对多种已知和新发现的致病菌。

5、先前，我们已经公开了“一种用于任意核酸编辑的组合物及方法”(202010157724.2)，在该专利中，我们公开了fen1类功能蛋白与dna探针组合物对核酸物质的切割作用，并在实施例8中，公开了对细菌中核酸物质进行切割。与之不同的，在本发明中，我们将公开的antib-sgn，是由另一种非fen1家族的功能蛋白与rna或dna探针共同形成的组合物，利用这种组合物对细菌中的内源或外源核酸物质进行切割。

6、另外，先前我们已经公开了“一种同时靶向rna与dna病毒的药物及应用”(202210153943.2)，其作用对象为病毒。与之不同的，在本发明中，antib-sgn作用对象是细菌。二者的结构不同，细菌是单核微生物，具有细胞壁等生物结构，而病毒结构比较单一，并不具备复杂结构，主要由核酸和蛋白质组成，因此，很难通过上一个专利，推断对细菌的作用是能成功的；另外，“一种同时靶向rna与dna病毒的药物及应用”(202210153943.2)专利也是基于fen1类功能蛋白与dna探针的组合物，而在本发明中，antib-sgn基于的是另一类非fen1家族的功能蛋白和rna探针的组合物，因此，很难通过上一个专利，推断antib-sgn对细菌的作用是能成功的。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对背景技术所指出的现有抗菌药物的不足，提供一种小型、无序列偏爱性、特异性较强的攻击细菌核酸遗传物质的策略作为补充，靶向破坏外源获得的耐药基因，恢复菌体对抗生素的敏感性。

2、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

3、一种用于逆转菌体耐药的antib-sgn系统，该antib-sgn系统包含：

4、(1)至少一个寡核苷酸探针，由两部分组成，一部分为能够与靶标耐药基因互补的引导序列，另一部分具有核酸二级结构；所述的寡核苷酸探针为dna探针或rna探针；

5、(2)antib-sgn蛋白分子、编码该蛋白分子的多核苷酸或者含有编码该蛋白分子的多核苷酸的质粒，所述的antib-sgn蛋白分子能够识别所述寡核苷酸探针的核酸二级结构，从而与寡核苷酸探针结合，再被寡核苷酸探针引导，与靶标菌核酸序列相结合破坏核酸序列。

6、作为本发明的一种优选，编码所述antiv-sgn蛋白分子的多核苷酸为dna或rna。

7、作为本发明的一种优选，所述的antiv-sgn蛋白分子以下任意一种：

8、(1)：thermus aquaticus dnapolymerase或其突变体的部分功能域或全酶片段；

9、(2)：thermus thermophilus dna polymerase或其突变体的部分功能域或全酶片段；

10、(3)：(1)和(2)中全酶或片段的融合物。

11、作为本发明的一种优选，所述的antiv-sgn蛋白为thermus aquaticus dnapolymerase和thermus thermophilus dna polymerase中各一部分融合之后形成的一种嵌合功能蛋白，其编码基因序列如seq id no.1所示。

12、作为本发明的进一步优选，所述的含有编码该蛋白分子的多核苷酸的质粒为将seq id no.1所示的嵌合功能蛋白编码基因插入pdcas9-bacteria质粒bgl ii/xho i酶切位点间得到。

13、作为本发明的进一步优选，当寡核苷酸探针为rna探针时，需要将化学合成的寡核苷酸探针插入质粒骨架构建成转录质粒。

14、本发明所述的antib-sgn系统在制备逆转或改善细菌对抗生素耐药的药物中的应用。

15、作为本发明的优选，所述的细菌为致病菌，选自葡萄球菌属、链球菌属、大肠杆菌属、结合分支杆菌属、伤寒杆菌属、痢疾杆菌属、螺旋杆菌属中的至少一种；进一步优选的，所述的致病菌为大肠杆菌属。

16、作为本发明的进一步优选，所述的耐药的抗生素选自β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、林可霉素类、氯霉素类或多肽类抗生素，优选的，所述的抗生素为β-内酰胺类或氨基糖苷类。

17、一种用于治疗细菌感染的药物，该药物中包含本发明所述的antib-sgn系统，优选包含本发明所述的antib-sgn系统和抗生素。

18、本发明的有益结果：

19、(1)本发明提供的新型基于攻击细菌核酸遗传物质的抗菌药物及其应用，无序列偏爱性，普适性强，适用于不同类型细菌、不同靶向基因，弥补了现在传统抗生素药物的不足。

20、(2)本发明提供的新型基于攻击细菌核酸遗传物质的抗菌药物及其应用，组分合成简单，作为药物可以显著降低成本。当适用于不同类型细菌、不同靶向基因时，只需改变探针的引导序列(仅20-30个碱基)，就可以靶向不同类型不同亚型的细菌基因组，只需很小的经济和时间成本，弥补了现在传统抗生素药物的不足。

21、(3)本发明提供的新型基于攻击细菌核酸遗传物质的抗菌药物及其应用，分子量远小于绝大多数已报道的cas蛋白，有利于体内递送，弥补了目前基于crispr/cas系统研发攻击细菌核酸的抗菌药物的不足。

22、(4)本发明提供的新型基于攻击细菌核酸遗传物质的抗菌药物及其应用，对非目标菌体(如有益菌)，生长毒副作用小。