识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体及其制备方法

本发明属于生物医药，涉及一种多克隆抗体的制备方法，具体涉及一种识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体及其制备方法。

背景技术：

1、金果榄为临床常用中药，来源于防己科植物青牛胆[tinospora sagittata(oliv.)gagnep.]或金果榄(tinosporacapillipesgagnep.)的干燥块根，具有清热解毒、利咽、止痛的功效，常用于咽喉肿痛、泄泻、痈疽疔毒等症。金果榄主产于四川、广西、湖南、贵州等地，金果榄药材中主要含有生物碱、萜类和甾醇类成分。其中萜类成分古伦宾为该药材主要活性成分之一，不同产地的金果榄中含古伦宾的量约为1.13～2.84％。

2、现代药理学研究表明，古伦宾具有抗癌、抗高脂血、抗炎活性。古伦宾能抑制干扰素-γ和脂多糖诱导的巨噬细胞中一氧化氮的生成。古伦宾可以延长由环己烯巴比妥诱导的小鼠的睡眠时间，并且可以缩短α-氯醛糖和乌拉坦混合物诱导的小鼠的睡眠时间。但是，也有研究表明，金果榄中的古伦宾具有肝脏毒性，然而古伦宾导致肝脏毒性的具体机制还不清楚。古伦宾经细胞色素p450酶代谢成具有反应活性的中间体，称之为反应性代谢产物，反应性代谢产物进而可能与生物大分子如蛋白质等发生共价结合。蛋白质作为生命过程中的各种重要功能的最终执行者，当这些蛋白质暴露于古伦宾的反应性代谢物，并与之共价结合后，一定会引起蛋白质活性的变化，而这些蛋白质活性的变化对一些生理和病理过程会产生重要影响。

3、因此，制备一种能够识别古古伦宾内共价结合蛋白质的抗体，对于研究古伦宾的致毒机制，评价古伦宾的毒性大小和临床诊断，具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题，提供了一种识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体及其制备方法来满足本领域内的这种需要。

2、基于现有文献及其揭示的研发成果，古伦宾是金果榄含量最高的指标成分，且报道有较强肝毒性，但对于其致毒机制鲜有报道。本发明通过研制一种能识别古伦宾体内共价结合蛋白质的多克隆抗体，从而加深古伦宾致毒的生化机制，并为毒性的检测提供一种有力的工具。本发明的目的在于制备能识别古伦宾体内共价结合蛋白质的多克隆抗体。

3、一方面，本发明涉及一种用于制备识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的免疫原，其包括：血蓝蛋白、二甲基过氧化酮和古伦宾。

4、进一步地，本发明提供的免疫原中，以质量比计，所述古伦宾和所述血蓝蛋白的配比为8:3；以mg:ml计，所述古伦宾和所述二甲基过氧化酮的配比为4:1。

5、进一步地，本发明提供的免疫原中，所述免疫原的制备方法包括：配制古伦宾的丙酮溶液，加入二甲基过氧化酮，加入血蓝蛋白的pbs溶液，于37℃下反应，即为所述免疫原。

6、进一步地，本发明提供的免疫原中，每8mg古伦宾配合2ml二甲基过氧化酮和3mg血蓝蛋白；所述古伦宾的丙酮溶液的浓度为4mg/ml；所述血蓝蛋白的pbs溶液的浓度为3mg/ml。

7、另一方面，本发明涉及一种识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的制备方法，其包括：将上述的用于制备识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的免疫原作为抗原进行动物免疫，获取识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体。

8、进一步地，本发明提供的识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的制备方法中，所述动物为兔子，包括：所述兔子背部选10处给药点，每个所述给药点注射1.0ml免疫乳剂；每隔两周，每个所述给药点注射1.0ml加强免疫乳剂直至检测所述兔子的血清效价不再上升时，停止免疫，分离所述兔子的血清，所述血清包含所述多克隆抗体；所述免疫乳剂包括：每200μl所述免疫原配合4.8mlpbs和5ml弗氏完全佐剂；所述加强免疫乳剂包括：每200μl所述免疫原配合4.8mlpbs和5ml弗氏不完全佐剂。

9、进一步地，本发明提供的识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的制备方法中，所述免疫乳剂的制备方法包括：将所述免疫原、pbs和弗氏完全佐剂混合，搅拌至得到白色乳剂；所述加强免疫乳剂的制备方法包括：将所述免疫原、pbs和弗氏不完全佐剂混合，搅拌至得到白色乳剂。

10、另一方面，本发明涉及一种识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体，其采用上述的制备方法得到。

11、具体地，本发明通过elisa法验证所述多克隆抗体的效价为122408。

12、另一方面，本发明提供的多克隆抗体具备效价高且对天然bsa蛋白交叉识别能力弱的优点。由此，本发明进一步请求保护一种用于检测古伦宾毒性的试剂盒，其包括上述的多克隆抗体。

13、本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：

14、本发明的主要贡献在于提供了一种古伦宾经模拟生物氧化过程与蛋白质结合成免疫原的方法，并提供兔子免疫和评价其产生抗体的质量。本发明制备了效价很强的抗体，为研究古伦宾与蛋白结合导致肝毒性的机制提供了一种强力的工具，为检测古伦宾体内共价结合物，研究古伦宾所致肝毒性，提供了一种新途径。本发明制备得到的识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体效价高达122408，且对天然bsa蛋白交叉识别能力弱。

技术特征：

1.一种用于制备识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的免疫原，其特征在于，包括：血蓝蛋白、二甲基过氧化酮和古伦宾。

2.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于，以质量比计，所述古伦宾和所述血蓝蛋白的配比为8:3；

3.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于，所述免疫原的制备方法包括：配制古伦宾的丙酮溶液，加入二甲基过氧化酮，加入血蓝蛋白的pbs溶液，于37℃下反应，即为所述免疫原。

4.根据权利要求3所述的免疫原，其特征在于，每8mg古伦宾配合2ml二甲基过氧化酮和3mg血蓝蛋白；

5.一种识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1～4任一项所述的免疫原作为抗原进行动物免疫，获取识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述动物为兔子，包括：所述兔子背部选10处给药点，每个所述给药点注射1.0ml免疫乳剂；

7.根据权利要求6所述的识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫乳剂的制备方法包括：将所述免疫原、pbs和弗氏完全佐剂混合，搅拌至得到白色乳剂；

8.一种识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体，其特征在于，采用权利要求5～7任一项所述的制备方法得到。

9.一种用于检测古伦宾毒性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的多克隆抗体。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多克隆抗体的制备方法，具体涉及一种识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体及其制备方法。该多克隆抗体的制备方法包括：合成免疫原，将所述免疫原作为抗原进行动物免疫获取多克隆抗体；所述合成免疫原包括：采用血蓝蛋白为载体，负载古伦宾合成所述免疫原。本发明提供了一种古伦宾经模拟生物氧化过程与蛋白质结合成免疫原的方法，制备得到的识别古伦宾共价结合蛋白质的多克隆抗体效价高达122408，且对天然BSA蛋白交叉识别能力弱。

技术研发人员：李维维,郑江,伍楚天,潘洁
受保护的技术使用者：贵州医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11