一种碳水化合物结合模块的基因、融合酶及应用

本发明涉及来源于生孢噬纤维菌(sporocytophaga sp.cx11)的碳水化合物结合模块smcbm6a及其编码基因与应用，属于生物工程。

背景技术：

1、纤维素是由吡喃型d-葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的线性多糖，是植物细胞壁的主要成分，是自然界中含量最丰富的生物质资源，全球每年纤维素的产量高达1000亿吨，然而只有少量的纤维素被利用。因此，将纤维素高效的转化为人类急需的能源、食品和化工原料对人类社会可持续发展具有重要的意义。

2、纤维素酶是能够水解纤维素中β-1，4糖苷键的一类酶的总称，包括内切纤维素酶(endoglucanase，ec3.2.1.4)、外切纤维素酶(cellobiohydrolase，ec3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，ec3.2.1.21)，三种酶协同作用将纤维素水解为葡萄糖(reetarani singhania et al.advancement and comparative profiles in the productiontechnologies using solid-state and submerged fermentation for microbialcellulases[j].enzyme and microbial technology,2010,46(7):541-549.)。纤维素酶一般由催化结构域、碳水化合物结合模块以及它们之间的linker构成。碳水化合物结合模块是糖苷水解酶家族中的一类不具有催化活性，但是能与底物结合的蛋白质结构。

3、1986年，在瑞氏木霉的纤维二糖水解酶ⅰ中发现了第一个碳水化合物结合模块，因其能识别和吸附纤维素，被命名为纤维素结合模块(herman van tilbeurgh etal.limited proteolysis of the cellobiohydrolase i from trichoderma reesei[j].febs letters,1986,204(2):223-227.)。后来，随着糖苷水解酶的不断被发现，在多种糖苷水解酶中都发现了这种类似结构，发现其除了能与纤维素结合外，还能与淀粉、几丁质、木聚糖等多种多糖结合，因此将其更名为碳水化合物结合模块(carbohydrate-bindingmodule，cbm)。

4、cbm一般位于酶的c端或者n端，通常由30-250个氨基酸组成，根据氨基酸序列相似性和吸附模块的3d结构，来源不同的cbm可以分为不同的家族。截至2022年8月，在cazy数据库中，最新更新的数据显示cbm可分成93个家族。根据其与底物的结合特性，可将其分为a、b、c三种类型，其中a型cbm表面具有芳香族氨基酸组成的疏水平面，通常与不溶性多糖结合，对可溶性多糖不具有亲和能力。b型cbm具有由极性氢键残基中心带组成的裂缝，可以与单个多糖链相互作用。c型cbm结合位点表现的口袋拓扑结构，能够有效识别多糖链的非还原末端(carvalho caio c et al.carbohydrate-binding module tribes.[j].biopolymers,2015,103(4):203-14.)。

5、cbm的主要功能是识别和吸附多糖，增加酶在底物表面的浓度，提高酶水解效率。研究发现，cbm还能破坏多糖的晶体结构，从而有利于催化结构域与底物结合，提高催化效率。同时，cbm还能增加酶的ph稳定性和温度稳定性(carla oliveira et al.recombinantcbm-fusion technology—applications overview[j].biotechnology advances,2015,33(3-4):358-369.)。选择合适的cbm与多糖水解酶进行融合表达，能有效提高酶的催化效率以及稳定性。li j通过计算机辅助从碳水化合物数据库中筛选出与甘露五糖具有最低结合能的tmcbm27，并将其分别与宇佐美曲霉的β-甘露聚糖酶auman5a的c端和n端进行融合，重组融合酶reauman5a-cbm6的热稳定性提高、ph稳定性变广、底物亲和力增强、催化效率提高(jianfang li etal.engineering a family 27carbohydrate-binding module intoan aspergillus usamiiβ-mannanase to perfect its enzymatic properties[j].journal of bioscience and bioengineering,2016,123(3):294-299.)。连接两个模块的linker也是影响融合酶功能的重要因素，选择合适的linker有助于融合酶的表达，增强融合酶的稳定性以及活性。li yangyang在源于嗜热菌的耐热木聚糖酶xynam1的n端和c端分别融合毛霉的碳水化合物结合亚模块cbm9-2，并且对两个模块之间的linker进行替换，发现选择柔性linker作为连接肽时效果最好(li yangyang et al.enhanced catalyticperformance of thermophilic gh11 xylanase by fusing carbohydrate-bindingmodule 9-2and linker for better synergistic degradation of wheat bran[j].process biochemistry,2022,121:349-359.)。柔性linker能保证两个融合模块不相互影响，避免折叠缠绕导致的活性下降，同时，能使各模块活性中心保持一定距离，避免空间位阻影响活性。迄今为止，cbm与多糖水解酶融合表达的研究依旧以寻找底物结合能力更强和稳定性更好的cbm为主。在以往的报道中，很少见到6家族的cbm在融合表达上的应用。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种具有广泛多糖结合能力cbm的编码基因与应用。

2、本发明提供了一种编码碳水化合物结合模块smcbm6a的基因，核苷酸序列为下述1a)或2a)中的一种或两种：

3、1a)如序列表中seq id no.3所示的核苷酸序列；

4、2a)与序列表中seq id no.3所示的核苷酸序列至少具有90％以上同源性，且能编码所述碳水化合物结合模块smcbm6a的dna序列。

5、本发明还提供了所述基因编码的碳水化合物结合模块smcbm6a，其氨基酸序列为下列1b)～3b)中的一种或两种以上：

6、1b)具有如序列表中seq id no.4所示氨基酸序列；

7、2b)对序列表中seq id no.4所示的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

8、3b)含有序列表中seq id no.4所示的氨基酸序列的具有相同功能的氨基酸序列。

9、一种表达载体或克隆载体，含有所述seq id no.3所述核苷酸序列的表达载体或克隆载体。

10、一种基因工程菌，其特征在于，所述工程菌含有权利要求3所述的表达载体或克隆载体。

11、进一步地，上述技术方案中，smcbm6a属于cbm6家族，结构为经典的β-三明治结构，分子量约为16.8kda。

12、本发明还提供了所述smcbm6a与非水溶性多糖结合的结果。

13、一种所述碳水化合物结合模块smcbm6a作为碳水化合物结合组件在构建融合酶中的应用。所述的融合酶为碳水化合物结合模块smcbm6a与多糖水解酶融合表达获得。

14、所述的多糖水解酶包括纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶、淀粉酶中的一种或两种以上。

15、一种碳水化合物结合模块smcbm6a与多糖水解酶融合表达获得的融合酶在多糖降解中的应用。所述多糖为非水溶性多糖。

16、进一步地，上述技术方案中所述的非水溶性多糖为几丁质、壳聚糖、滤纸、avicel、甘蔗渣木聚糖、榉木木聚糖、支链淀粉中的一种或两种以上。

17、进一步地，上述技术方案中，所述smcbm6a对滤纸、木聚糖、几丁质等多种多糖底物都具有较高的结合能力，其中对几丁质类底物有更强的结合能力，对几丁质粉末和壳聚糖粉末的结合率高达90％。

18、本发明还提供了所述smcbm6a与水溶性多糖结合的结果。

19、进一步地，上述技术方案中所述的水溶性多糖为羧甲基纤维素钠(cmc-na)、黄原胶、魔芋胶、菊糖、玉米芯木聚糖。

20、进一步地，上述技术方案中，所述smcbm6a对水溶性多糖不具有结合能力。

21、编码基因smcbm6a容易异源表达，获得有活性的目的蛋白。编码smcbm6a的基因是由生孢噬纤维菌cx11的内切纤维素酶sm_1350前体蛋白基因去除信号肽以及催化结构域序列，保留了两端的linker后制得。编码基因smcbm6a装载在pet28a载体上得到重组质粒，然后转入到大肠杆菌e.coli bl21(de3)宿主中得到工程菌。该重组工程菌株经过发酵培养，超声破碎，包涵体变复性后得到大量活性smcbm6a蛋白。

22、上述smcbm6a蛋白、编码基因smcbm6a、重组质粒或重组工程菌株在多糖水解以及蛋白纯化上的应用。

23、本发明的有益效果：

24、本发明的碳水化合物结合模块smcbm6a，属于cbm6家族，大小约为16.8kda，容易异源表达，包涵体变复性后能获得大量有活性的纯蛋白。smcbm6a对木聚糖、几丁质、纤维素等多种多糖底物都具有较强的结合能力，尤其是对几丁质底物的结合率达到90％。本发明为多糖水解酶的融合提供了新的材料，可以将smcbm6a与多糖水解酶融合或者替换多糖水解酶中原有cbm，以增强其底物结合能力，提高催化效率，获得性能更优越的水解酶。同时，基于该cbm与几丁质底物的强结合能力，可以将其作为蛋白的纯化标签，应用于蛋白纯化。