基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双miRNA的检测方法及其应用

本发明涉及生物医学诊断，尤其是涉及一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法及其应用。

背景技术：

1、前列腺癌是一种恶性上皮性肿瘤，是泌尿外科最常见的肿瘤之一，也是男性癌症死亡的第五大原因。早期筛查和诊断对于提高患者生存率极为重要。目前临床常用的前列腺癌诊断方法是血清前列腺特异性抗原(psa)检测结合前列腺穿刺活检。然而，血清psa检测的敏感性和特异性均有不足。

2、近年来，液体活检技术以其通过识别肿瘤细胞、核酸和外泌体等标志物来获得体液中肿瘤或基因特征信息的特点受到越来越多关注。液体活检技术与病理活检相比，具有相对较高的准确性，且无需侵入性穿刺。其中，液体活检技术中关键的是微小rna(mirna)，mirna是一种短的非编码rna，长度为18-25个核苷酸，可在尿液中检测到并且稳定存在，已被认为是一种早期特异性生物标志物。越来越多的证据表明，多个mirna同时检测对前列腺癌诊断更为敏感和特异。

3、对于尿液mirna的检测方法，像实时定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)，这样的传统方法在同时检测多个mirna方面仍然存在局限性，且检测时间长、需要严格的温度控制，酶的引入也增加了成本。

4、在之前的研究中，发明人团队使用cdte量子点(qds)作为信号分子，利用其和ag+之间的阳离子交换反应导致荧光猝灭的特点，并结合催化发卡自组装(cha)和杂交链式反应(hcr)等无酶核酸信号扩增技术以及多种检测仪器，实现了mirna-141的定量分析。然而该策略并未实现多种mirna的同时检测，且检测灵敏度为10fm，不能完全保证尿液样本中超痕量的mirna检测。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，以解决现有技术实采用qrt-pcr，同时检测多个mirna方面仍然存在局限性，且检测时间长、需要严格的温度控制，酶的引入也增加了成本的技术问题。

2、本发明的目的之二在于提供一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的检测尿液中双mirna的检测方法的应用。

3、为了实现上述目的之一，本发明提供了一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，所述方法包括提取尿液中的mirna-375和mirna-148a，所述mirna-375和所述mirna-148a与发卡结构hp杂交，以及与辅助链触发催化发卡组装放大反应，同时释放hg2+和ag+，然后基于cds选择性识别hg2+，以及基于cdteqds选择性识别ag+，最后基于cds的荧光信号和cdteqds的荧光信号定量所述mirna-375和所述mirna-148a。

4、根据一种可选实施方式，所述发夹结构hp包括发卡结构hp1、发卡结构hp2和发卡结构hp3。

5、根据一种可选实施方式，所述发卡结构hp1为c-ag+-c@t-hg2+-t，所述发卡结构hp2为双重c-ag+-c，所述发卡结构hp3为双重t-hg2+-t。

6、根据一种可选实施方式，所述mirna-375和所述mirna-148a与所述发卡结构hp1杂交，形成hp1-mirnas双链结构。

7、根据一种可选实施方式，所述hp1-mirnas结构与探针helper1和探针helper2结合，形成helper1-hp1-helper2结构，同时所述mirna-375和所述mirna-148a被释放，游离的所述mirna-375和所述mirna-148a再次与所述发卡结构hp1杂交，释放hg2+和ag+。

8、根据一种可选实施方式，所述发卡结构hp2和所述发卡结构hp3同时与所述helper1-hp1-helper2结构结合，释放双倍hg2+和ag+，同时形成稳定的hp2-helper1-hp1-helper2-hp3结构。

9、根据一种可选实施方式，所述cds和所述cdteqds一先一后添加，所述cds消耗hg2+，所述cdteqds消耗ag+。

10、为了实现上述目的之二，本发明提供了一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法的应用，所述应用包括将上述任一所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法应用于临床前列腺癌的诊断。

11、本发明提供的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法及其应用，具有以下技术效果：

12、该发明从分析仪器、分析步骤和成本、信号报告分子的选择、多重核酸信号放大技术和选择性识别现象的应用等方面着手，建立简单、快速、灵敏、同时均相的尿液双mirna定量分析策略，无需使用昂贵仪器或试剂，缩短了检测时间，实现了室温条件下尿液双mirna的同时高敏检测，并且经验证相较于血清psa提高了前列腺癌的诊断敏感性和特异性，丰富了医学诊断体系，为实现快速、简单、无创的前列腺癌诊断奠定基础。

技术特征：

1.一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，其特征在于，所述方法包括提取尿液中的mirna-375和mirna-148a，所述mirna-375和所述mirna-148a与发卡结构hp杂交，以及与辅助链触发催化发卡组装放大反应，同时释放hg2+和ag+，然后基于cds选择性识别hg2+，以及基于cdteqds选择性识别ag+，最后基于cds的荧光信号和cdteqds的荧光信号定量所述mirna-375和所述mirna-148a。

2.根据权利要求1所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，其特征在于，所述发卡结构hp包括发卡结构hp1、发卡结构hp2和发卡结构hp3。

3.根据权利要求2所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，其特征在于，所述发卡结构hp1为c-ag+-c@t-hg2+-t，所述发卡结构hp2为双重c-ag+-c，所述发卡结构hp3为双重t-hg2+-t。

4.根据权利要求2所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，其特征在于，所述mirna-375和所述mirna-148a与所述发卡结构hp1杂交，形成hp1-mirnas双链结构。

5.根据权利要求4所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，其特征在于，所述hp1-mirnas结构与探针helper1和探针helper2结合，形成helper1-hp1-helper2结构，同时所述mirna-375和所述mirna-148a被释放，游离的所述mirna-375和所述mirna-148a再次与所述发卡结构hp1杂交，释放hg2+和ag+。

6.根据权利要求5所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，其特征在于，所述发卡结构hp2和所述发卡结构hp3同时与所述helper1-hp1-helper2结构结合，释放双倍hg2+和ag+，同时形成稳定的hp2-helper1-hp1-helper2-hp3结构。

7.根据权利要求1所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法，其特征在于，所述cds和所述cdteqds一先一后添加，所述cds消耗hg2+，所述cdteqds消耗ag+。

8.一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双mirna的检测方法的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1-7任一所述的基于多重信号放大和金属离子选择性识别尿液中双mirna的检测方法应用于临床前列腺癌的诊断。

技术总结
本发明提供了一种基于多重信号放大和金属离子选择性识别现象的尿液中双miRNA的检测方法及其应用，涉及生物医学诊断技术领域，该方法包括提取尿液中的miRNA‑375和miRNA‑148a，与发卡结构HP杂交，以及与辅助链触发催化发卡组装放大反应，同时释放Hg<supgt;2+</supgt;和Ag<supgt;+</supgt;，其分别与CDs和CdTeQDs识别反应，最后基于CDs的荧光信号和CdTeQDs的荧光信号定量miRNA‑375和miRNA‑148a。该发明从分析仪器、分析步骤和成本、信号报告分子的选择、多重核酸信号放大技术和选择性识别现象的应用等方面着手，建立简单、快速、灵敏、同时均相的尿液双miRNA定量分析策略。

技术研发人员：陈飘飘,蒋鹏骏,陈捷
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13