一种DNA装配分子机器及其应用

本发明涉及分子生物，具体而言，涉及一种dna装配分子机器及其应用。

背景技术：

1、dna测序技术的开发对于近代生物探索、疾病诊断及人类溯源均具有重要的意义。随着测序技术的进步，从扩增后的间接测序向原位单分子测序发展。无论是pacbio tsms单分子荧光测序技术还是ont的电生理测序技术，测序长度、准确率和效率都严重依赖于控制dna移动与装配的分子马达。其中，pacbio主要利用和华大智造的dnb-seq技术都依赖于phi29聚合酶的滚环扩增，在该技术中需要phi29聚合酶具备较高的热稳定性和活性。而在纳米孔测序中，现有的聚合酶的活性过高又使得dna易位过孔速率过快，很难将dna易位穿孔的时间从10us提升到100us，而对dna装配分子机器的要求又需要其具备较高的耐盐性能，需要耐受300mm以上的盐浓度。

2、目前已有的phi29聚合酶专利对其耐热性和耐盐性都分别做了改造，如专利wo2021248757a1中通过73个点突变提高了商业化phi29聚合酶的热稳定性，其中突变组合m97t、y224k和e515s的热稳定tm值从48.5℃提高到50.8℃，可见对商业化phi29聚合酶的改造不仅难度大，而且很难显著改变酶的特性。在专利cn201910778360中公开了一种新型耐盐聚合酶，相比于phi29聚合酶和taq dna聚合酶，该专利中的聚合酶能够耐受氯化钠的拐点为300mm，大于500mm以后失去活性，而且该聚合酶在钙离子、锌离子和锂离子条件下易失活。因此，进一步设计新型的dna装配分子机器来提高耐盐性、热稳定性以及对重金属离子的耐受性是本领域需要解决的技术瓶颈。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种dna装配分子机器及其应用以解决上述技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种500-1000个氨基酸组成的dna装配分子机器，其包括掌结构域、2个末端插入结构域、拇指结构域、手指结构域和外切酶活性结构域；其中，掌结构域由150-220个氨基酸组成，拇指结构域由40-70个氨基酸组成，手指结构域由30-45个氨基酸构成α螺旋结构，外切酶活性结构域由150-220个氨基酸组成；2个末端插入结构域包括末端插入结构域1和末端插入结构域2，末端插入结构域1由50-150个氨基酸组成，末端插入结构域2由20-70个氨基酸组成；

4、dna装配分子机器具有如下功能：

5、通过氨基酸侧链与核苷酸相互作用的能力；且dna装配分子机器具有装载和/或连接dna分子的能力。

6、dna装配分子可以通过氨基酸侧链与游离的核苷酸的碱基相互作用，或者与磷酸盐骨架相互作用。在一种可选的实施方式中，上述dna装配分子具有装载和/或连接引物链、模板链的作用。

7、由掌结构域、2个末端插入结构域、拇指结构域、手指结构域和外切酶活性结构域组成的dna装配分子机器具有良好的稳定性，可以用于等温扩增。本发明提供的dna装配分子及其突变体具备在多种金属离子、不同温度下的dna组装功能，可应用于纳米孔测序、单分子测序、rca建库、环境检测和体外诊断。尤其在高盐浓度下，具有远优于现有dna聚合酶的扩增活性，可以通过提高盐浓度，延长dna易位穿孔的时间，从而提高单分子测序的准确率，极大程度上减少关键测序信息的丢失。

8、在一种可选的实施方式中，上述掌结构域由150-200个氨基酸组成，或者由160-220个氨基酸组成，或者由180-220个氨基酸组成。

9、在一种可选的实施方式中，上述拇指结构域由40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个氨基酸组成，在外切酶活性结构域与掌结构域之间形成长度为30-45埃的结构域，防止dna装配过程中酶与dna的解离。

10、在一种可选的实施方式中，上述手指结构域由30个、32个、36个、38个、40个或45个氨基酸构成α螺旋结构，该段结构主要功能是结合dna，并协助外切酶活性的功能。

11、在一种可选的实施方式中，上述外切酶活性结构域由150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个或220个氨基酸组成。

12、末端插入结构域包括末端插入结构域1和末端插入结构域2，末端插入结构域1由50-150个氨基酸组成，末端插入结构域2由20-70个氨基酸组成，实现模板链与非模板链的有效分离，有助于有效的链位移和连续性。

13、在本发明应用较佳的实施方式中，dna装配分子机器的各结构域的氨基酸类型选自如下至少一种：天然氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸。

14、天然氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、胱氨酸，或者上述氨基酸的c1-c4烷基酯。

15、非天然氨基酸选自对-乙酰基-苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、对-炔丙基氧基苯丙氨酸、对-叠氮基-苯丙氨酸、β-丙氨酸(βala)、6-氨基己酸(aca)以及一端为氨基、一端为羧基的三缩四乙二醇(teg，nh2-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-o-ch2ch2-cooh)、naek、lys-azido、或其它含有双吖丙啶、叠氮结构中的一种、两种或三种。

16、上述修饰选自：糖基化、磷酸化、泛素化、s-亚硝基化、甲基化、n-乙酰化、琥珀酰化、羟基化、脂质化和聚异戊二烯化中的至少一种。

17、在一种可选的实施方式中，甲基化选自n-甲基化或o-甲基化；

18、在一种可选的实施方式中，糖基化选自adp核糖基化。

19、在本发明应用较佳的一个实施方式中，掌结构域上有两段形成β折叠片的氨基酸序列。

20、两段形成β折叠片的氨基酸序列分别为：ewkfkmv和atat；

21、对β折叠片的氨基酸序列(ewkfkmv)删除(βdel)，会导致装配活性降低。

22、在一种可选的实施方式中，拇指结构域上有一段形成α螺旋的氨基酸序列：dpndfteeeikrkni。

23、在一些实施例中，本发明提供的dna装配分子与现有的dna聚合酶相比，在拇指结构域上包括能形成α螺旋结构的序列，该α螺旋对于dna的装配尤为关键，删除拇指结构域上形成α螺旋结构的序列后，会导致dna装配分子丧失dna扩增活性。该结构属于dna装配分子的关键序列。

24、发明人发现：在拇指结构域上形成α螺旋结构对于提高dna装配分子的dna扩增活性具有关键作用，具体的机理为：该结构提高了dna与酶的结合能力。如seq id no：1-7任一项所示的氨基酸序列在拇指结构域上形成α螺旋结构，如seq id no：8-9任一项所示的氨基酸序列在拇指结构域上没有形成α螺旋结构。

25、在本发明应用较佳的实施方式中，dna装配分子机器包括：

26、(a)：由seq id no:1所示的氨基酸序列进行突变获得的突变体，其中，突变体与dna相互作用的位点上至少一个的氨基酸被取代或被修饰；

27、和/或，seq id no：1所示的氨基酸序列中插入一个或多个氨基酸；

28、和/或，seq id no：1所示的氨基酸序列中缺失一个或多个氨基酸；

29、和/或，seq id no：1所示的氨基酸序列进行侧链修饰；

30、或(b)：由seq id no:2，seq id no:3，seq id no:4，seq id no:5，seq id no:6，seq id no:7，seq id no:8或seq id no:9所示的氨基酸序列进行突变获得的突变体，其中，突变体的突变位置通过如下方式确定：将突变体与seq id no：1所示的序列比对，突变体的突变位置对应于seq id no：1所示的序列的功能位点；突变体在突变位置的氨基酸中的至少一个被取代、缺失、插入或者被修饰。

31、序列比对方法可使用blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行protein blast比对；采用本领域熟知的其他序列比对方法或工具也可以得到相同的结果。

32、需要说明的是，由seq id no：2-9任一项所示的序列进行突变获得的突变体的突变位置与seq id no：1相比，可能位置相同，也可能不同(例如seq id no：2，3和5)，突变的具体位置根据前述序列比对后确定，只要其通过与参考序列(seq id no：1)比对后，对应于seq id no：1的位点即为本发明所述的突变位点。

33、seq id no：1所示的氨基酸序列来源于芽孢杆菌噬菌体(bacillus phage)，长度为606aa，与phi29的序列相似性为58％。uniprot数据库编号为a0a1x9sgt8。

34、seq id no：2-9的氨基酸序列信息参照表1所示。

35、表1基因表

36、

37、在本发明应用较佳的实施方式中，(a)：seq id no:1所示的氨基酸序列中被取代或修饰的氨基酸是d12,e14,t15,y60,h62,n63,f66,d67,f70,v94,s123,l124,d146,y149,d170,d257,v258,s260,y262,t365,i372,w374,k378,k379,r338,k392,l393,n396,s397,y399,g400,f402,k428,e429,t443,d465,d467,k507,y509和k547中的至少一个；

38、(b)：功能位点是seq id no：1所示序列的d12,e14,t15,y60,h62,n63,f66,d67,f70,v94,s123,l124,d146,y149,d170,d257,v258,s260,y262,t365,i372,w374,k378,k379,r338,k392,l393,n396,s397,y399,g400,f402,k428,e429,t443,d465,d467,k507,y509和k547中的至少一个。

39、seq id no：1所示序列的各功能位点的功能具体如下表2所示：

40、表2 seq id no:1关键功能位点(a0a1x9sgt8)

41、

42、发明人发现，针对d12蛋白突变后，会导致蛋白装配活性下降，而同时进行d12a和d67a的突变后，会导致蛋白装配活性丧失。这与现有的phi29蛋白对d12和d67位点突变后dna扩增活性增强的效果完全不同。

43、在一种可选的实施方式中，对seq id no:2所示的如下至少一个位点进行突变：d27，e29，t30，y77，h79，f83，d84，f87，l113，s138，l139，d161，y164，d185，d265，v266，s268，y270，s372，i379，k381，v385，k386，r394，k398，l399，n402，a403，y405，g406，f408，e435，e436，t450，r455，d472，d474，k512，y514和k550；

44、在一种可选的实施方式中，对seq id no:3所示的如下至少一个位点进行突变：d9，e11，t12，y56，h58，f62，d63，f66，t93，s122，l123，e145，y148，d169，d249，v250，s252，y254，v357，i364，r366，i370，k371，v381，k385，l386，n389，s390，y392，g393，f395，k421，e423，t436，r440，d458，d460，k500，y502和k532；

45、在一种可选的实施方式中，对seq id no:5所示的如下至少一个位点进行突变：d272，e274，t275，y322，h324，f328，d329，f332，s371，s395，l396，d418，y421，d442，d532，v533，s535，y537，v667，k676，i680，k681，r689，k693，l694，n697，n698，y700，g701，m703，r728，a729，t744，r748，d771，d773，k812，y814和k834。

46、四种典型的聚合酶关键功能位点的相对应位点如表3所示：

47、

48、

49、在本发明应用较佳的实施方式中，dna装配分子机器包括：

50、与seq id no：1-9任一项所示的氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的同源性的多肽。

51、本发明的dna装配分子机器受激动剂调节，可以使用的激动剂包括：0.01-100mm的co2+，ni2+，cu2+，mn2+，zn2+，ca2+中的至少一种离子。尤其是在钙离子浓度条件下，本发明提供的dna装配分子展现出了比其他蛋白(phi29)更高的dna扩增活性。

52、第二方面，本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述的dna装配分子机器。

53、第三方面，本发明还提供了一种载体或重组细胞，其含有上述的核酸分子。

54、在此以其最通常的意思来使用术语“载体”并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其能够使所述核酸例如引入原核生物和/或真核生物细胞中，并且在合适的情况下，整合至基因组中。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。载体包含质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。如在此所用的术语“质粒”通常涉及染色体外基因材料的构建体，通常是环状dna双链，其可以独立于染色体dna而进行复制。

55、术语“重组细胞”指的是可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明的术语“重组细胞”包含原核生物(例如，大肠杆菌)或真核生物细胞(例如，哺乳动物细胞，特别是人细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，如来自人、鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可以源自多个组织类型，并且包含初级细胞和细胞系。核酸可以以单拷贝形式或两个或多个拷贝形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在重组细胞中表达。

56、在一种可选的实施方式中，重组细胞为真核细胞；

57、在一种可选的实施方式中，重组细胞为哺乳动物细胞；

58、在一种可选的实施方式中，重组细胞为hek293。

59、第四方面，本发明还提供了dna复制或扩增方法，其包括采用上述的dna装配分子机器作为dna聚合酶复制或扩增dna。

60、第五方面，本发明还提供了dna装配分子机器在如下任一种应用中的用途：

61、1)作为dna聚合酶；

62、2)作为rna聚合酶；

63、3)控制dna或者rna的移动；

64、4)制备单分子测序试剂或试剂盒；

65、5)制备纳米孔测序试剂或试剂盒；

66、6)装配分子机器链式反应；

67、7)催化dna复制和/或催化dna扩增；

68、8)催化滚环扩增和/或催化多重链置换扩增；

69、9)进行dna测序或rna测序或全基因组测序；

70、10)rca建库；

71、11)基因组扩增覆盖度检测；

72、12)制备用于催化dna复制和/或催化dna扩增的试剂盒产品；

73、13)制备用于催化滚环扩增和/或催化多重链置换扩增的产品；

74、14)制备用于进行dna测序或rna测序或全基因组测序的产品；

75、15)制备用于rca建库的产品；

76、16)制备用于基因组扩增覆盖度检测的产品。

77、第六方面，本发明还提供了采用上述的dna装配分子机器进行dna分子装配的方法，其包括在反应体系中进行反应；反应体系包括0.3m-1.5m的盐离子。

78、本发明提供的dna装配分子机器在盐离子浓度高于300nm时，活性要高于phi29。表明本发明提供的dna装配分子机器可以适用于高盐浓度环境中，比如纳米孔测序。

79、在一种可选的实施方式中，盐离子为钠、钾、钙、镁、锰、镍、钴、铜或锌。

80、在一种可选的实施方式中，反应体系还包括钙离子。

81、本发明具有以下有益效果：

82、本发明提供的dna装配分子与现有的dna聚合酶相比，在拇指结构域上具有能形成α螺旋结构的序列，该α螺旋结构对于提高dna装配分子的dna扩增活性尤为关键。dna装配分子稳定性好，适用于等温扩增。

83、此外，本发明提供的dna装配分子及其突变体具备在多种金属离子、不同温度下的dna组装功能，可应用于纳米孔测序、单分子测序、rca建库、环境检测和体外诊断。尤其在高盐浓度下，具有远优于现有dna聚合酶的扩增活性，可以通过提高盐浓度，延长dna易位穿孔的时间，从而提高单分子测序的准确率，极大程度上减少关键测序信息的丢失。