一种猫A型血天然抗原的提取纯化及其多抗和应用的制作方法

本发明涉及生物，具体设计一种猫a型血天然抗原的提取纯化及其多抗和应用。

背景技术：

1、研究发现，猫的血型只有a型、b型、ab型三种，没有o型血。虽然都有a，b，ab型，但是猫的血型的遗传法和人类完全不同。在猫的血型基因中，a型血是显性基因，只需要一组染色体即可显现a型血特征。而b型血是隐性的，一只幼猫必须从父母那里都继承b型血基因才可能获得b型血。而ab型血是独立遗传的，对于b型血来说是显性的，而对于a型是隐性的。

2、猫在紧急情况下失血过多需要输血。一般情况下，输血必须用同型的血液。因为猫中ab型非常稀少，可以用a型血代替。但是由于b型血中含有非常强的a型抗体，所以不能用b型血代替。猫没有血液库，一旦需要输血就需要健康猫上现采，因此，提前知道猫的血型对于猫失血过多的紧急救治极为重要。

3、目前在国内，猫血型的鉴别卡价格较贵，因此猫的血型鉴别并不普及。特别的，b型血猫由于数量少，一旦需要输血，短时间内很难找到匹配的供血猫。因此，急需一种便捷、快速、准确的方法对猫的血型进行检测。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种猫a型血天然抗原(cab天然抗原)的提取纯化方法，目前市面上无法购买到用于猫血型鉴别的人工合成抗原，因此只能通过红细胞上提取a抗原，定义为cab天然抗原。cab天然抗原分子量较大，能够诱导动物机体产生特异性抗体。

2、一种猫a型血天然抗原(cab天然抗原)的提取纯化方法，采用如下技术方案：

3、步骤(1)、将猫a型血用pbs溶液稀释，低温离心，弃上清得到沉淀；

4、作为优选，步骤(1)离心的转速为3000转/min；离心时间为10分钟；

5、作为优选，步骤(1)离心温度为4℃；

6、作为优选，步骤(1)猫a型血与pbs溶液的体积比为10：1。

7、步骤(2)、将沉淀溶于生理盐水，吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀；重复上述步骤多次；

8、作为优选，步骤(2)离心的转速为3000转/min；离心时间为15分钟；

9、作为优选，步骤(2)离心温度为4℃；

10、作为优选，步骤(2)重复次数为3次。

11、步骤(3)、将步骤(2)所得沉淀加入氯化铵中吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀，重复上述步骤多次；

12、作为优选，步骤(3)离心的转速为13000～15000转/min；离心时间为15分钟；

13、作为优选，步骤(3)离心温度为4℃；

14、作为优选，步骤(3)重复次数为3次。

15、步骤(4)、将步骤(3)所得沉淀溶于生理盐水，吹打均匀，低温离心，弃上清取沉淀，重复上述步骤直至沉淀变成乳白色，即得cab天然抗原；

16、作为优选，步骤(4)离心的转速为10000转/min；离心时间为15分钟；

17、作为优选，步骤(4)离心温度为4℃。

18、步骤(5)、用0.01mol/l pbs溶液溶解cab天然抗原，然后加入平衡完成的磁珠，孵育一段时间后洗涤，最后洗脱磁珠上的抗原，即进一步纯化的cab天然抗原；所述磁珠上通过表层琼脂糖的游离端结合了猫a型血单克隆抗体。

19、作为优选，步骤(5)磁珠的孵育时间为60min。

20、作为优选，步骤(5)磁珠的洗涤时间为10min，磁珠洗脱时间为15min。

21、本发明的第二个目的是提供一种抗cab多克隆抗体，由cab天然抗原在免疫过程中产生，效价高、特异性强。

22、本发明的第三个目的是提供上述抗cab多克隆抗体的制备方法，其如下：

23、步骤(1)、将cab天然抗原稀释，与佐剂混合后对动物进行多次免疫，直至动物血清的效价满足进一步纯化的要求；将血清用硫酸铵纯化后获得抗体半成品；

24、步骤(2)、制备偶联高纯度cab天然抗原的亲和柱；

25、具体是将100ml ge-sepharose-4b填充胶用溴化氢活化，再将cab天然抗原蛋白溶于0.01m碳酸盐缓冲液(ph＝9.6)，立刻加入到活化好的填充胶中，搅拌均匀后过夜；然后用乙醇胺封闭，0.01m pbs冲洗平衡。

26、步骤(3)、将获得的抗体半成品过cab天然抗原的亲和柱，收集流穿液，中间用elisa测定效价；

27、步骤(4)、流穿液浓缩后透析多次，收集测定浓度体积，得到抗cab多克隆抗体，-20℃保存。

28、本发明采用高度提纯后的cab天然抗原制成亲和柱，可在不大影响抗cab多克隆抗体效价和灵敏度的同时进一步提升其特异性及纯度，使其能更好的应用于猫血型检测试剂盒中。

29、本发明的第四个目的是提供上述抗cab多克隆抗体在制备猫血型检测试剂盒中的应用。

30、进一步的，所述的猫血型检测试剂盒，包括样品垫，反应膜和吸样垫；反应膜分为a，b，c三个区域，所述反应膜的a区域包被有抗cab多克隆抗体，b区域包被有识别b血型的抗体，c区域包被有识别ab血型的抗体。

31、本发明的试纸条是以抗原抗体高度亲和原理制备的，抗cab多克隆抗体的包被量也是以所述抗cab多克隆抗体对猫a型血有效凝集的检测限为宜。检测时，若a区域和c区域血液凝集，则测试的猫血型为a型；若b区域和c区域血液凝集，则测试的猫血型为b型；若a区域，b区域和c区域血液凝集，则测试的猫血型为ab型。

32、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

33、1.本发明在提取纯化cab天然抗原时采用了结合有猫a型血单克隆抗体的磁珠，经该磁珠纯化后得到的抗原纯度较高，特异性好，能刺激动物产生大量抗cab多克隆抗体，而非其他不需要的抗体，为后续纯化提供便利；

34、2.免疫获得的抗cab抗体，通过自制cab亲和柱的纯化，能有效剔除抗体中剩余的小部分猫全血抗体，进一步提升灵敏度(检测限可达500ng/ml)，提高纯度。

技术特征：

1.一种猫a型血天然抗原的提取纯化方法，其特征在于，所述提取纯化方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中离心的转速为3000转/min；离心时间为10分钟；离心温度为4℃。

3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中猫a型血与pbs溶液的体积比为10：1。

4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中离心的转速为3000转/min；离心时间为15分钟；离心温度为4℃。

5.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)的重复次数均为3次。

6.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(3)中离心的转速为13000～15000转/min；离心时间为15分钟；离心温度为4℃。

7.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，步骤(4)中离心的转速为10000转/min；离心时间为15分钟；离心温度为4℃。

8.一种抗cab多克隆抗体，其特征在于，由猫a型血天然抗原在免疫过程中产生。

9.权利要求8所述抗cab多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.权利要求8所述抗cab多克隆抗体在制备猫血型检测试剂盒中的应用。

技术总结
本发明公开一种猫A型血天然抗原的提取纯化及其多抗和应用，对猫A型血进行离心和破碎提纯后，获得猫A型血红细胞上突出在细胞表面的A抗原，高度提纯后获得本发明所述猫A型血天然抗原，即CAB天然抗原，免疫抗原特异性好，能刺激动物产生大量抗CAB多克隆抗体。本发明提供的抗CAB多克隆抗体，通过采集免疫CAB天然抗原的动物血清，再通过亲和层析法获得。抗CAB多克隆抗体通过CAB亲和柱的纯化，在不大幅降低抗体效价灵敏度的情况下，进一步提升灵敏度，提高纯度。

技术研发人员：谢清
受保护的技术使用者：杭州傲锐生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13