一种黏细菌来源的β-1,3-葡聚糖酶及其组合物在植物疫霉病生物防治中的应用

本发明属于农业微生物及植物保护领域，公开了一种黏细菌孢囊杆菌科来源的三个β-1,3-葡聚糖酶及其组合物的制备方法及其在植物疫霉病防控方面的应用。

背景技术：

1、植物病害是制约农作物优质高产的重要因素之一，据估计全球主要农作物的平均病害损失约占总产量的近20-40％，易造成严重的经济损失。目前，农业生产过程中植物病害主要是由细菌、真菌以及卵菌所引起的，利用物理熏蒸、化学农药处理、耕作与农业管理、植物抗病育种以及生物防治等手段能够有效的抑制病害的发生，在植物病害高效防控和作物优质高产方面发挥着重要的作用。随着基因编辑技术的快速发展，植物抗病育种周期的缩短使得利用抗病基因提高植物抗病性具有重要的研究价值，在此过程中，挖掘性能优良的抗菌蛋白至关重要。

2、真菌细胞壁主要由β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖、几丁质等多糖组成。与之不同的是，以疫霉菌为代表的卵菌细胞壁则主要由β-1,3-葡聚糖、纤维素组成，其中部分成员细胞壁包含少量的β-1,6-葡聚糖和几丁质。因此，β-1,3-葡聚糖是植物致病性真核微生物细胞壁的保守结构，也是广谱抗菌药物研发的重要靶点，如植物来源的抗菌化合物poacic acid通过靶向病原菌细胞壁中β-1,3-葡聚糖的合成进而抑制其生长(js piotrowski et al.,2015)。β-1,3-葡聚糖酶是一类重要的抗菌因子，已被广泛应用植物抗病育种。目前具有良好抗菌活性的β-1,3-葡聚糖酶主要来源于植物和微生物。然而，已报道的β-1,3-葡聚糖酶在活性和催化特性方面存在较大的不同，而病原菌细胞壁结构复杂，这也是β-1,3-葡聚糖酶抗菌性质具有较大差异的重要原因之一。此外，在长期进化过程，病原菌通过细胞壁组分动态变化和结构修饰等方式抵御β-1,3-葡聚糖酶对其细胞壁的水解，进而减弱其抗菌作用。因此，相关研究者也开发了β-1,3-葡聚糖酶与蛋白酶，β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶等组合物来提高抗菌特性。

3、黏细菌是一类具有捕食特性的新型生防微生物，在植物病害控制方面具有重要的应用潜力。目前黏细菌来源的广谱抗菌蛋白主要包括珊瑚球菌来源的β-1,6-葡聚糖酶在抗植物病原真菌方面的应用(zl 201510816987.9)等，而黏细菌来源的β-1,3-葡聚糖酶等抗菌蛋白的专利较少。基于黏细菌类群拮抗病原菌策略的多样性，如抑制和捕食等，本专利以疫霉菌为代表的真核微生物细胞壁中β-1,3-葡聚糖为作用靶点，开发具有广谱高效抗疫霉菌活性的β-1,3-葡聚糖酶及其组合物，对于植物疫霉病生物防控具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供来源于黏细菌的三种新的β-1,3-葡聚糖酶及其编码基因，所述酶可以通过氨基酸序列基序(一级结构)、二级结构元件以及三级结构元件和氨基酸序列在线blast比对来识别。该β-1,3-葡聚糖酶来源于黏细菌，孢囊杆菌科(cystobacteraceae)，原囊菌属(archangium)。

2、本发明的另一目的是提供含有该β-1,3-葡聚糖酶基因的基因工程菌。

3、本发明的又一目的是提供该基因以及该基因所编码的蛋白质的应用。

4、本发明所述三个β-1,3-葡聚糖酶基因acglu13.1，acglu13.2和acglu13.3，其核苷酸序列分别为：seq id no.1，seq id no.2和seq id no.3。

5、本发明所述的三个β-1,3-葡聚糖酶基因编码的β-1,3-葡聚糖酶蛋白质acglu13.1,acglu13.2和acglu13.3，其氨基酸序列分别为：seq id no.4，seq id no.5和seq id no.6。所述的β-1,3-葡聚糖酶acglu13.1最适反应ph为8.0，最适反应温度为60℃，以昆布多糖为底物时比活力为339.8u/mg,以茯苓多糖为底物时比活力为426.8u/mg。β-1,3-葡聚糖酶acglu13.2最适反应ph为7.0，最适反应温度为60℃，以昆布多糖为底物时比活力为31.9u/mg，对茯苓多糖无活性。β-1,3-葡聚糖酶acglu13.3最适反应ph为6.0，最适反应温度为60℃，以昆布多糖为底物时比活力为757.3u/mg，以茯苓多糖为底物时比活力154.4u/mg。

6、本发明提供了β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列在线blast序列比对，得到来源于孢囊杆菌科的与本发明的β-1,3-葡聚糖酶同源性高于50％的序列,所获得的同源序列编码蛋白来源于ncbi数据库，其蛋白功能均未验证。本发明随机挑选与本发明所述的三个β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列同源性高于50％的具有代表性蛋白，且来源于孢囊杆菌科中的archangium,stigmatella,cystobacter,hyalangium和vitiosangium等5个属进行异源表达功能验证，发现不同来源的同源蛋白均具有β-1,3-葡聚糖水解活性，这些蛋白在ncbi中的登录号为wp_204490482.1、eau62082.1、wp_095981735.1、wp_108065359.1、epx59331.1、wp_044196135.1、wp_239470089、ado71648.1、wp_020918155、wp_224360605和wp_075207634epx62475.1等。这些蛋白的功能也属于本发明保护范围。

7、含本发明所述的β-1,3-葡聚糖酶基因的重组微生物，优选以大肠杆菌为宿主菌。

8、本发明提供一种酶组合物，包括seq id no.4，seq id no.5和seq id no.6所述的β-1,3-葡聚糖酶及其同源蛋白，任意两种或三种组合，为增强抗菌效果，优选的，所述的acglu13.1，acglu13.2和acglu13.3的浓度≥0.1μg/ml。

9、本发明所述的β-1,3-葡聚糖酶及其酶组合物优选在防治和控制疫霉菌对植物的损害中的应用。

10、其中，所述的植物病原卵菌-疫霉菌导致的病害：马铃薯晚疫病菌，大豆疫霉，辣椒疫霉，烟草疫霉等。

11、有益效果

12、1.本发明以从土样中筛选出的黏细菌菌株原囊菌为材料，通过发酵上清蛋白纯化和鉴定，获得三个高活性β-1,3-葡聚糖酶acglu13.1，acglu13.2和acglu13.3，以昆布多糖为底物时比酶活分别为339.8，31.9和757.3u/mg。通过蛋白质氨基酸测序结合pcr扩增，成功获得β-1,3-葡聚糖酶基因序列，分别命名为acglu13.1，acglu13.2和acglu13.3。

13、2.通过序列对比，得到了与acglu13.1，acglu13.2和acglu13.3同源性高于50％的蛋白序列，发现本专利所述的三个蛋白及其同源蛋白均来源于孢囊杆菌科所含的archangium,stigmatella,cystobacter,hyalangium和vitiosangium等5个属。同时，选取相关同源蛋白进行基因合成和异源表达蛋白功能验证，发现这些来源的同源蛋白均具有β-1,3-葡聚糖水解活性。

14、3.利用本专利所述的三个β-1,3-葡聚糖酶，通过两两组合或者三者组合，发现基于两酶或三酶的组合物在≥0.1μg/ml浓度条件下显著增加对疫霉的拮抗活性。

15、4.含有β-1,3-葡聚糖酶的原囊菌ac19发酵上清酶液显著抑制大豆疫霉的生长，对疫霉病具有良好的生防效果。

16、5.含有该β-1,3-葡聚糖酶的混合物及其植物转基因材料可用于植物健康保护、农业病害防治和农产品处理等方面。