腺相关病毒突变体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种腺相关病毒突变体及其应用。

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)是一类包裹着线性单链dna基因组的无包膜小病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。aav基因组为单链dna片段，包含于非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框(rep基因、cap基因)和末端反向重复序列(itr)。重组腺相关病毒载体(raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，作为基因转移载体在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，raav被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，如基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

2、神经系统疾病种类繁多、表型复杂，影响中枢神经系统(cns)的疾病对患者的生活质量和身心健康造成严重影响，但目前使用的传统药物疗法疗效不持久，并且存在较高的脱靶风险。近年来，随着aav体内递送载体、基因编辑技术、rna干扰等分子生物学技术的不断发展，基因治疗可能为中枢神经系统单基因和特发性疾病提供靶向性的长期解决方案。aav是目前用于体内递送转基因至cns的主要载体，其具有高效转导的能力、高度可工程化的细胞靶向性、低毒性和克服物理屏障(包括血脑屏障)的潜力，这些优势为人们带来了令人振奋的前景和众多临床成功的例子。其中以脊髓性肌萎缩症(sma)为代表的神经系统遗传性疾病，近年来在基因治疗取得了突破性的进展。例如zolgensma是2019年在美上市的一款基于aav9型载体的基因疗法，用于治疗2岁以下患有运动神经元存活基因1(smn1)等位突变导致的脊髓性肌萎缩症的儿童患者。该药优势在于其可以透过血脑屏障，给予患者一次性注射治疗，治疗效果有望持续终身。然而其一次性治疗费用高昂，这与其静脉注射剂量高相关，达到了1.1e14 vg/kg。此外，大剂量的aav使用不足之在于：一方面工艺开发控制纯度难度大，生产成本高；另一方面则由于大剂量的aav潜在副作用突显，使用风险增大。

3、因此，鉴于成功的基因治疗需要使治疗性基因在靶细胞中有效表达，并且要尽量减少副作用，使得运载工具的效率和靶向性极为关键。在天然的众多aav血清型中，aav9因其对多种组织器官的靶向效率高，并能穿越血脑屏障，在神经系统疾病的基因治疗方面备受瞩目。但是，aav9缺点之一是其特异性差，且全身高剂量注射情况下，肝毒性尤为明显。

4、综合上述，虽然aav是当前最安全的基因治疗载体之一，已广泛应用于基因治疗领域。但受阻于特异性问题，剂量需求高，尤其是通过全身注射穿过血脑屏障进入神经系统的治疗方式，剂量需求更高，成本和费用也急剧上升，患者难以承担。另外特异性低、剂量高也使得药物的潜在毒副作用更为明显。因此，研发神经系统靶向性更好，剂量需求和费用更低的aav，对神经系统疾病的临床基因治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有大脑和脊髓靶向性的腺相关病毒突变体及其应用，该腺相关病毒突变体神经系统靶向性更好，剂量需求更低。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、第一方面，本发明筛选了一种具有大脑和/或脊髓靶向性的异源肽，所述异源肽的氨基酸序列为如seq id no.1～8中任一所示的序列。

4、本发明以aav9为亲本骨架，利用定向筛选的方法，经过几轮的小鼠体内器官的筛选和富集，筛选出包含8种异源肽的具有突变衣壳蛋白的raav突变体，所述异源肽在体内具有靶向大脑和脊髓的特性。

5、作为本发明所述的异源肽的优选实施方式，所述异源肽的核苷酸序列为如seq idno.9～16中任一所示的序列。

6、第二方面，本发明提供了一种具有大脑和/或脊髓靶向性的aav衣壳蛋白突变体，包括所述的异源肽。

7、本发明通过所述aav衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体特异性更高，安全性更好，应用范围广。

8、作为本发明所述的aav衣壳蛋白突变体的优选实施方式，由所述异源肽插入或置换aav衣壳蛋白的5～20个氨基酸而得。

9、作为本发明所述的aav衣壳蛋白突变体的优选实施方式，所述异源肽的插入位点位于aav衣壳蛋白氨基酸586和589之间。

10、作为本发明所述的aav衣壳蛋白突变体的优选实施方式，其氨基酸序列为如seqid no.17～seq id no.24中任一所示的序列。

11、作为本发明所述的aav衣壳蛋白突变体的优选实施方式，其核苷酸序列为如seqid no.25～seq id no.32中任一所示的序列。

12、第三方面，本发明提供了一种具有大脑和/或脊髓靶向性的重组腺相关病毒，包括所述的aav衣壳蛋白突变体。

13、本发明的8个突变体具有远超亲本aav9的神经系统靶向性，部分突变体还具有低于亲本aav9的肝嗜性，是特异性良好的血清型突变体。其中经小鼠体内筛选获得的突变体6，感染大脑的能力是亲本aav9的28.5倍。脊髓感染能力最强的则为突变体3，是aav9的31.61倍。同时还对大脑和脊髓感染能力强而肝脏嗜性低的突变体7进行腰穿鞘内注射，其对大脑和脊髓神经元的感染效果也远远高于同剂量的aav9。

14、作为本发明所述的重组腺相关病毒的优选实施方式，还包括异源目的基因。

15、作为本发明所述的重组腺相关病毒的优选实施方式，所述异源目的基因编码干扰rna、适配体、内切核酸酶、指导rna中任一种基因产物。

16、第四方面，本发明将所述的异源肽、所述的aav衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织的药物中应用。

17、作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述细胞为神经类细胞。

18、第五方面，本发明将所述的异源肽、所述的aav衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备体内靶向大脑和/或脊髓的递送工具中应用。

19、第六方面，本发明将所述的异源肽、所述的aav衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备治疗神经系统类疾病的递送药剂中应用。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

21、本发明通过定向筛选的方法，筛选获得了8个靶向神经系统的血清型突变体，分别从mrna和蛋白表达水平验证了其靶向小鼠大脑和脊髓的能力。本发明的8个突变体具有远超亲本aav9的神经系统靶向性，部分突变体还具有低于亲本aav9的肝嗜性，是特异性良好的血清型突变体，所述aav衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体特异性更高，安全性更好，应用范围广，为广大疾病患者提供更好的神经系统类疾病的基因治疗载体工具，具有巨大的临床价值和商业应用场景。

技术特征：

1.一种具有大脑和/或脊髓靶向性的异源肽，其特征在于，所述异源肽的氨基酸序列为如seq id no.1～8中任一所示的序列。

2.根据权利要求1所述的异源肽，其特征在于，所述异源肽的核苷酸序列为如seq idno.9～16中任一所示的序列。

3.一种具有大脑和/或脊髓靶向性的aav衣壳蛋白突变体，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的异源肽。

4.根据权利要求3所述的aav衣壳蛋白突变体，其特征在于，由所述异源肽插入或置换aav衣壳蛋白的5～20个氨基酸而得。

5.根据权利要求3或4所述的aav衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述异源肽的插入位点位于aav衣壳蛋白氨基酸586和589之间。

6.根据权利要求5所述的aav衣壳蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列为如seq idno.17～seq id no.24中任一所示的序列。

7.根据权利要求6所述的aav衣壳蛋白突变体，其特征在于，其核苷酸序列为如seq idno.25～seq id no.32中任一所示的序列。

8.一种具有大脑和/或脊髓靶向性的重组腺相关病毒，其特征在于，包括权利要求3～7任一项所述的aav衣壳蛋白突变体。

9.根据权利要求8所述的重组腺相关病毒，其特征在于，还包括异源目的基因。

10.根据权利要求9所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述异源目的基因编码干扰rna、适配体、内切核酸酶、指导rna中任一种基因产物。

11.权利要求1或2所述的异源肽、权利要求3～7任一项所述的aav衣壳蛋白突变体、权利要求8～10任一项所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织的药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述细胞为神经类细胞。

13.权利要求1或2所述的异源肽、权利要求3～7任一项所述的aav衣壳蛋白突变体、权利要求8～10任一项所述的重组腺相关病毒在制备体内靶向大脑和/或脊髓的递送工具中的应用。

14.权利要求1所述的异源肽、权利要求2～6任一项所述的aav衣壳蛋白突变体、权利要求7～8任一项所述的重组腺相关病毒在制备治疗神经系统类疾病的递送药剂中的应用。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种具有大脑和脊髓靶向性的腺相关病毒突变体及其应用。本发明筛选了一种具有大脑和/或脊髓靶向性的异源肽，所述异源肽的氨基酸序列为如SEQ ID No.1～8中任一所示的序列；提供了一种包括所述的异源肽的AAV衣壳蛋白突变体；提供了一种包括所述的AAV衣壳蛋白突变体的重组腺相关病毒。本发明的AAV衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体特异性更高，安全性更好，应用范围广，为广大疾病患者提供更好的神经系统类疾病的基因治疗载体工具，具有巨大的临床价值和商业应用场景。

技术研发人员：李华鹏,卜晔,钟育健,张有为,代志勇,潘越,陈欢
受保护的技术使用者：广州派真生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15