一种用于扩增血清型登革I型病毒基因组的引物组与试剂盒及应用

本发明属于基因组测序领域，涉及一种用于扩增血清型登革i型病毒基因组的引物组与试剂盒及应用。

背景技术：

1、登革病毒是一种重要的蚊媒病毒，属黄病毒科黄病毒属，为单股正链rna病毒，分为i、ii、iii和iv共四个血清型。登革病毒可引起一种称为登革热的急性传染病，临床特征主要为发热、皮疹、关节痛等。登革热主要在全球热带及亚热带地区流行，近30年来在全球呈现快速上升及蔓延趋势。自1978年登革热在广东省佛山再现，尤其是1990年后，中国每年都有登革热流行，2014年中国尤其是广东/广州出现由1型登革病毒造成4万余病例的大规模疫情暴发流行。登革热对民众健康产生了严重威胁。

2、当前，常用的获得病毒基因组测序技术包括pcr-sanger测序、宏基因组测序技术。

3、(1)pcr-sanger测序，通过使用覆盖全基因组片段区域引物pcr扩增，再对扩增获得的大量片段进行sanger测序(一代测序)获取片段序列进行拼装。该技术繁琐、人力成本高、操作周期长；

4、(2)近年来出现的基于宏基因组二代测序技术，可以不需要借助引物或探针从样本中检测出样品中的所有病毒序列，且可检出新病毒。但目前面临数据利用率低、检测成本高和组装基因组所需数据量大等技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于特异性扩增血清型登革i型病毒基因组的引物组。

2、本发明的目的还在于提供一种含有上述引物组的用于快速特异性扩增血清型登革i型病毒的靶向扩增试剂盒。

3、本发明的最后一个目的在于提供上述引物组或试剂盒在制备扩增血清型登革i型病毒基因组产品中的应用。

4、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于扩增血清型登革i型病毒基因组的引物组，所述引物组包括引物对1～引物对16，每对引物均由正向引物与反向引物组成，所述引物对1～引物对16的核苷酸序列依序如seq id no：1-32所示。

5、作为本发明的优选方案，将所述引物组中引物对1～引物对16分为两个引物库，分别为第一个引物库和第二个引物库，其中第一个引物库由引物对1、引物对3、引物对5、引物对7、引物对9、引物对11、引物对13和引物对15组成；第二个引物库由引物对2、引物对4、引物对6、引物对8、引物对10、引物对12、引物对14和引物对16组成。

6、也就是说，上述引物对seq id no：1-32所示的16对引物对中的第1对、3对、5对、7对、9对、11对、13对和15对为第一个引物库，上述引物对seq id no：1-32所示的16对引物对中的第2对、4对、6对、8对、10对、12对、14对和16对为第二个引物库。

7、引物使用需说明，上述引物必须成对使用，以“一对”作为一个选择单元，例如seqid no：1和seq id no：2组成一对编号为1(md1-36f和md1-956r的引物对，其余以此类推。

8、引物使用需说明，上述引物对必须成套使用，以“引物库”作为一个选择单元。本发明最优选的技术方案是，选择seq id no：1-32所示的16对引物对组成2个引物库，用于靶向扩增测序获得登革i型病毒全基因组。

9、具体的，本发明引物组包括置于引物池1中的第一个引物库中的引物以及置于引物池2中的第二个引物库中的引物：

10、

11、

12、本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于快速扩增血清型登革i型病毒的靶向扩增试剂盒，包括所述引物组。

13、优选的，所述引物组分为两个引物库。

14、作为本发明优选的技术方案，本发明所述试剂盒还包括逆转录试剂组分。

15、优选的，所述逆转录试剂组分包括逆转录酶和逆转录酶缓冲液。

16、优选的，所述逆转录酶为super script iii逆转录酶。

17、作为本发明优选的技术方案，本发明试剂盒还包括靶向扩增试剂组分，所述靶向扩增试剂组分包括聚合酶、dntp和聚合酶的缓冲液。

18、作为本发明进一步优选的技术方案，本发明所述靶向扩增试剂组分包括高保真聚合酶、dntp和高保真聚合酶的缓冲液。

19、作为本发明优选的技术方案，本发明所述试剂盒还包括测序建库组分。

20、优选的，所述测序建库组分包括末端修复酶、末端修复缓冲液、t4 dna连接酶、t4dna连接酶缓冲液。

21、作为本发明优选的技术方案，本发明用于快速扩增登革i型病毒的靶向扩增试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

22、本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述引物组、试剂盒在制备扩增血清型登革i型病毒基因组产品中的应用。

23、本发明还提供了一种基于靶向扩增快速获得血清型登革i型病毒全基因组的方法，包括以下步骤：

24、(1)样本rna提取；

25、(2)逆转录生成cdna；

26、(3)使用上述的引物组靶向扩增；

27、(4)建库测序，对测序序列数据进行分析，获得登革i型病毒全基因组。

28、在该基于靶向扩增快速获得血清型登革i型病毒全基因组的方法中：

29、优选的，步骤(1)中所述样本为血清样本或蚊虫样本。

30、优选的，步骤(3)中使用上述的引物组靶向扩增时，将引物组按照上述分为2组，分别使用第一个引物库和第二个引物库扩增，然后收集两组的扩增产物。

31、优选的，步骤(4)中对测序序列数据进行分析，包括：(a)测序数据过滤质控；(b)将测序序列比对到登革i型病毒参考基因组；(c)生成一致性序列的全基因组。

32、优选的，步骤(a)中测序数据过滤质控包括：去除序列两端28bp碱基的序列；过滤读长低于500bp的序列；过滤碱基测序质量值小于6占比大于50％的序列。

33、作为本发明优选的技术方案，本发明步骤(4)中对测序序列数据进行分析时，服务器配置cpu至少16核32线程，内存至少32g。若在低于该配置上的服务器上进行测序分析操作，最终获得登革i型病毒基因组的分析时间将变长。

34、本发明具有以下优点：

35、(1)本发明靶向扩增引物组具有特异性较强、测序精度高、通量大的优势，成本显著低于基于sanger测序或宏基因组测序的方法，最快可在24小时内得到全基因组序列，大大缩短了实验周期；

36、(2)本发明靶向扩增引物组共有16对引物构成，其可覆盖扩增当下所有流行的登革i型病毒毒株，扩增效率高，交叉干扰少；

37、(3)本发明中的引物对可以良好扩增登革i型病毒的所有亚型，无需担心由于引物结合效率不良的问题；

38、(4)以本发明扩增子所构建的下游测序方法和分析方法所获基因组测序精度高、测序通量大。

技术特征：

1.一种用于扩增血清型登革i型病毒基因组的引物组，其特征是：所述引物组包括引物对1～引物对16，每对引物均由正向引物与反向引物组成，所述引物对1～引物对16的核苷酸序列依序如seq id no：1-32所示。

2.根据权利要求1所述的用于扩增血清型登革i型病毒基因组的引物组，其特征是：将所述引物组中引物对1～引物对16分为两个引物库，分别为第一个引物库和第二个引物库，其中第一个引物库由引物对1、引物对3、引物对5、引物对7、引物对9、引物对11、引物对13和引物对15组成；第二个引物库由引物对2、引物对4、引物对6、引物对8、引物对10、引物对12、引物对14和引物对16组成。

3.一种用于快速扩增血清型登革i型病毒的靶向扩增试剂盒，其特征是：包括权利要求1或权利要求2中所述引物组。

4.一种基于靶向扩增快速获得血清型登革i型病毒全基因组的方法，其特征是包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述基于靶向扩增快速获得血清型登革i型病毒全基因组的方法，其特征是：步骤(1)中所述样本为血清样本或蚊虫样本。

6.根据权利要求4所述基于靶向扩增快速获得血清型登革i型病毒全基因组的方法，其特征是：步骤(3)中使用权利要求1中的引物组靶向扩增时，将引物组按照权利要求2中分组，分别使用第一个引物库和第二个引物库扩增，然后收集两组的扩增产物。

7.根据权利要求4所述基于靶向扩增快速获得血清型登革i型病毒全基因组的方法，其特征是步骤(4)中对测序序列数据进行分析，包括：(a)测序数据过滤质控；(b)将测序序列比对到登革i型病毒参考基因组；(c)生成一致性序列的全基因组。

8.根据权利要求7所述基于靶向扩增快速获得血清型登革i型病毒全基因组的方法，其特征是：步骤(a)中测序数据过滤质控包括：去除序列两端28bp碱基的序列；过滤读长低于500bp的序列；过滤碱基测序质量值小于6占比大于50％的序列。

9.权利要求1-2所述引物组、权利要求3所述试剂盒在制备扩增血清型登革i型病毒基因组产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于扩增血清型I型登革病毒(DENV‑1)基因组的引物组。所述引物组包括引物对1～引物对16，每对引物均由正向引物与反向引物组成，所述引物对1～引物对16的核苷酸序列依序如SEQ ID NO：1‑32所示。还公开了含有上述引物组的用于快速扩增登革1型病毒的靶向扩增试剂盒。本发明靶向扩增引物组共有16对引物构成，其可覆盖扩增当下所有流行的登革1型病毒毒株，扩增效率高，交叉干扰少；同时以本发明扩增子所构建的下游测序方法和分析方法所获基因组测序精度高、测序通量大。

技术研发人员：郭祥,张晓晴,刘晓华,钟嘉瑶,周晓红
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13