甲基化转化组合物及其应用的制作方法

本文涉及甲基化转化组合物，尤其是其中包括碳酸乙烯酯的甲基化转化组合物。本文还涉及该甲基化转化组合物在dna甲基化检测中的应用。

背景技术：

1、甲基化修饰是一种重要的表观遗传学修饰方式，承载着大量的生物学信息。一般的测序技术只能区分atcg四种碱基序列，不能区分甲基化或未发生甲基化修饰的c碱基。1992年，frommer将重亚硫酸盐处理结合测序进行dna甲基化检测(bisulfite sequencing，bs-seq)，通过化学方法将未发生甲基化修饰的胞嘧啶转化成尿嘧啶，测序后未发生甲基化修饰的c碱基读为t碱基，发生甲基化修饰的c碱基保持不变，检测基因组中发生甲基化修饰的c碱基水平，bs-seq成为甲基化测序的金标准。基于亚硫酸盐转化的甲基化二代测序技术主要包括全基因组亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing，wgbs)、简化型亚硫酸盐测序(reduced representation bisulfite sequencing，rrbs)、基于多重pcr扩增的靶向甲基化测序技术(target bisulfite sequencing，tbs)和基于液相杂交捕获靶向甲基化检测技术等。这些测序技术均需要借助转化模块，才能够完成相应甲基化文库的构建。

2、目前市面上基于重亚硫酸盐原理的转化试剂盒种类较多，zymo的ez dnamethylation goldtm kit和qiagen的epitect fast dna bisulfite kit都是比较成熟的商品化产品。这些产品主要基于柱纯化的方式进行转化，转化流程较为繁琐，转化时间较长。随着表观遗传学技术的发展，甲基化检测技术在癌症早筛早诊领域发挥着越来越重要的作用，对于转化模块的便捷性以及操作灵活性提出了更高的要求。

3、市面上主流的重亚硫酸盐转化模块主要采用柱纯化方案，转化流程较为繁琐，转化时间较长，对样本损伤较为严重，复杂区域转化不完全。随着ngs测序技术的发展，自动化工作站已经完全能够替代人工操作，完成常规dna文库构建流程，但是基于亚硫酸盐转化的甲基化二代测序技术流程较为繁琐，目前尚未完全实现自动化。主流的柱纯化亚硫酸氢盐转化需要借助离心机才能够完成整个实验流程，因此此种转化方案是限制甲基化测序文库落地自动化工作站的主要限制因素。

技术实现思路

1、在一方面，本文提供了甲基化转化组合物，包括亚硫酸氢盐和保护剂，其中所述保护剂包括碳酸乙烯酯。

2、在一些实施方案中，以重量计，碳酸乙烯酯在所述甲基化转化组合物中的含量为5-10％，优选5％。

3、在一些实施方案中，所述亚硫酸氢盐在所述甲基化转化组合物中的浓度为4-9m，优选4.5-6.3m，更优选5.25m。

4、在一些实施方案中，所述亚硫酸氢盐选自亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵及其组合，优选亚硫酸氢钠与亚硫酸氢铵的组合。

5、在一些实施方案中，所述甲基化转化组合物的ph值为4.9-5.5。

6、在一些实施方案中，所述保护剂还包括0.1m水溶性维生素e和/或0.2m盐酸胍和/或2-2.5mm对苯二酚。

7、另一方面，本文提供了甲基化转化试剂盒，其包括上述甲基化转化组合物。

8、在一些实施方案中，所述甲基化转化试剂盒还包括磁珠纯化试剂和/或脱磺酸试剂和/或洗脱试剂。

9、在一些实施方案中，所述磁珠纯化试剂包括磁珠和磁珠结合缓冲液，所述磁珠优选bis-beads；所述结合缓冲液包括30-50％(wt)peg、1.0-2.0m的nacl和0.2m的tris-hcl，ph 5.0。

10、在一些实施方案中，所述脱磺试剂包括2.8-3.6m的naoh、1.2-1.5m的tris-hcl和0.2m的edta，ph为13-14。

11、在一些实施方案中，所述洗脱试剂为去离子水。

12、另一方面，本文提供了对dna分子进行甲基化转化的方法，包括让所述dna分子与上述甲基化转化组合物接触或者使用上述甲基化转化试剂盒。

13、在一些实施方案中，所述接触指的是75℃转化，时间40min。

14、在一些实施方案中，所述甲基化转化包括将所述dna分子置于所述甲基化转化组合物中，并且于95℃处理10min，于75℃处理40min。

15、本文提供的基于重亚硫酸盐的转化组合物或试剂盒，衔接甲基化建库试剂盒，可完成甲基化测序文库的构建。本文提供的试剂盒采用磁珠纯化方案，能够实现自动化应用方案。创新的磁珠产品能够对转化文库实现最大程度的抓取，回收效率相较spri beads系列至少提高60％。特殊的磁珠脱磺技术，避免了重复移液带来的损失。此外，转化试剂能够很好地改善高投入量样本下低gc覆盖较差的情况，使得测序数据利用率较高。试剂盒适用于10-1000ng样本转化，文库转化率达到99％以上，整个转化试剂盒操作时长不超过2h。

技术特征：

1.甲基化转化组合物，包括亚硫酸氢盐和保护剂，其中所述保护剂包括碳酸乙烯酯；优选地，所述保护剂还包括0.1m水溶性维生素e和/或0.2m盐酸胍和/或2-2.5mm对苯二酚。

2.如权利要求1所述的甲基化转化组合物，其中，以重量计，碳酸乙烯酯在所述甲基化转化组合物中的含量为5-10％，优选5％。

3.如权利要求1或2所述的甲基化转化组合物，其中，所述亚硫酸氢盐在所述甲基化转化组合物中的浓度为4-9m，优选4.5-6.3m，更优选5.25m。

4.如权利要求1或2所述的甲基化转化组合物，其中所述亚硫酸氢盐选自亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵及其组合，优选亚硫酸氢钠与亚硫酸氢铵的组合。

5.如权利要求1或2所述的甲基化转化组合物，其ph值为4.9-5.5。

6.甲基化转化试剂盒，包括权利要求1-5任一项所述的甲基化转化组合物。

7.如权利要求6所述的甲基化转化试剂盒，还包括磁珠纯化试剂和/或脱磺酸试剂和/或洗脱试剂；

8.对dna分子进行甲基化转化的方法，包括让所述dna分子与权利要求1-5任一项所述的甲基化转化组合物接触或者使用权利要求6或7所述的甲基化转化试剂盒。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述接触指的是75℃转化，时间40min。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述甲基化转化包括将所述dna分子置于所述甲基化转化组合物中，并且于95℃处理10min，于75℃处理40min。

技术总结
本文提供了甲基化转化组合物，包括亚硫酸氢盐和保护剂，其中所述保护剂包括碳酸乙烯酯。本文还提供了包括该甲基化转化组合物的甲基化转化试剂盒。本文提供的基于重亚硫酸盐的转化组合物或试剂盒，衔接甲基化建库试剂盒，可完成甲基化测序文库的构建。本文提供的甲基化转化组合物能够很好地改善高投入量样本下低GC覆盖较差的情况，使得测序数据利用率较高。本文提供的试剂盒采用磁珠纯化方案，还能够实现自动化应用方案。

技术研发人员：余丽萍,储俊东,吴强
受保护的技术使用者：纳昂达（南京）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12