高产木霉菌素的紫杉木霉基因工程菌株、方法及应用

本发明属于生物工程,尤其是一株高产木霉菌素的紫杉木霉菌株、构建方法及应用。

背景技术：

1、木霉菌素属于单端孢霉烯类化合物，这类化合物有大约两百种，属于倍半萜类化合物，是绿色木霉(trichodermaviride)、紫杉木霉(trichodermataxi)和拟枝孢镰刀菌(fusariumsprotrichoioides)等丝状真菌的代谢产物，能有效地抑制立枯丝核菌、灰葡萄孢等多种植物病原真菌地生长，主要应用于生物防治领域。在生物防治领域，木霉菌素能够影响真核生物蛋白合成的延伸与终止过程，是一种优良的蛋白合成抑制剂，其通过与60s-核糖体亚基结合位点结合而抑制肽转移酶活性，进而影响蛋白质合成地起始、延伸和终止阶段，最终阻止蛋白质的合成，可以用于新型农药的生产。木霉菌素是紫杉木霉的主要生物防治功能因子，具有开发成为一种良好的新型生防制剂的潜力。但是，木霉菌素存在调控机制不清晰、合成网络复杂、合成水平低等问题。

2、目前，木霉菌素生产途经主要是微生物发酵法。微生物发酵法以可利用再生碳源等优点日益受到重视，然而，目前发酵法生产木霉菌素存在的问题仍是缺乏优良的生产菌株，利用紫衫木霉野生型菌株进行紫外诱变获得菌株发酵合成木霉菌素，虽然能够获得632.16mg/l的产量，但是由于诱变后的紫杉木霉菌株稳定性较差、发酵效价较低，且诱变筛选的工作量太大，限制了其工业应用。近年来应用基因工程策略，对哈茨木霉、短密木霉等微生物代谢途径进行改造获得基因工程菌株的方法取得较大进展，但是由于产量不够高或者有大量副产物的存在等瓶颈，严重限制了发酵法生产木霉菌素的工业化进程。因此构建一种高产木霉菌素的紫杉木霉菌株，以提高木霉菌素的生产效率十分必要。

3、通过检索,尚未发现与本发明专利申请相关的公开文献。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题,提供一株高产木霉菌素的紫杉木霉菌株、构建方法及应用。

2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

3、一株高产木霉菌素的紫杉木霉(trichodermataxi)基因工程菌株，所述紫杉木霉基因工程菌株是过表达了乙酰基转移酶基因tri3和细胞色素p450加氧酶tri11的紫杉木霉基因工程菌株。

4、进一步地，所述乙酰基转移酶基因tri3的基因序列为ncbi-locus_tag为ky860616.1；所述乙酰基转移酶基因tri3编码的氨基酸序列为seq id no.2；所述细胞色素p450加氧酶tri11的基因序列为ncbi-locus_tag为ky860620.1；所述细胞色素p450加氧酶tri11编码的氨基酸序列为seq id no.4。

5、如上所述的高产木霉菌素的木霉菌素基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

6、(1)构建乙酰基转移酶基因tri3过表达载体

7、以野生型紫杉木霉trichodermataxizjuf0986基因组为模板，通过pcr反应扩增获得基因tri3的序列片段，回收pcr产物获得目的片段；将基因tri3的序列片段克隆到载体plh509(北京华大基因合成，seq id no.6)，构建基因tri3过表达质粒plh1541；

8、(2)乙酰基转移酶基因tri3过表达菌株的获得

9、将所述质粒plh1541转化至紫杉木霉宿主菌株s2531中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组，获得紫杉木霉乙酰基转移酶基因tri3过表达菌株s2729；

10、(3)构建细胞色素p450加氧酶基因tri11过表达载体

11、以野生型紫杉木霉trichodermataxizjuf0986基因组为模板，通过pcr反应扩增获得基因tri11的序列片段，回收pcr产物获得目的片段；将基因tri11的序列片段克隆到载体plh1080(北京华大基因合成，seq id no.7)，构建基因tri11过表达质粒plh1756；

12、(4)乙酰基转移酶基因tri3和细胞色素p450加氧酶基因tri11共过表达菌株的获得

13、将所述质粒plh1756转化至tri3基因过表达菌株s2729中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组，获得紫杉木霉乙酰基转移酶基因tri3和细胞色素p450加氧酶基因tri11共过表达菌株。

14、进一步地，所述紫杉木霉宿主菌株s2531的构建方法包括如下步骤：

15、将tet-on调控cre表达的由北京华大基因合成的质粒plh472(tet-on-cre,hph，seq id no.5)转化至紫杉木霉野生型菌株zjuf0986([1]章初龙,王国平,郑必强,陈绍瑗,林福呈.紫杉木霉zjuf0986抗真菌活性代谢产物分离提取及其活性研究[j].菌物学报,2008(03):439-446.)中，经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组，获得高产木霉菌素的紫杉木霉基因工程菌株的宿主菌s2531。因此可以实现对loxp-hph-loxp元件中潮霉素抗性基因hph的重组去除，从而可以反复使用hphmarker实现连续的对多个基因的过表达或敲除。

16、进一步地，所述紫杉木霉宿主菌株s2531基因组内整合了外源cre基因，该基因受tet-on系统的调控表达；当以所述菌株s2531为出发菌进行遗传改造，并以loxp-hph-loxp为筛选标记时，能够通过强力霉素启动tet-on系统表达cre重组酶，实现对loxp-hph-loxp元件的重组，从而实现应用一个hph marker进行连续的基因过表达或敲除且实现最终目的工程菌株基因组内无外源抗性基因的残留。

17、如上所述的紫杉木霉基因工程菌株在生产木霉菌素方面中的应用。

18、利用如上所述的基因工程菌株发酵生产木霉菌素的方法，包括如下步骤：

19、将紫杉木霉基因工程菌株接种在mea培养基上，于30℃培养五天，至菌体铺满平板，收集菌丝并将菌丝悬液接种于种子培养基中，28℃恒温180rpm培养48h，将培养物以10％(v/v)的接种量接入发酵培养基，在25℃恒温150rpm培养7天，即得木霉菌素。

20、进一步地，所述mea培养基的成分及配制方法为：

21、葡萄糖10g/l，胰蛋白胨4g/l，酵母浸出物3g/l，麦芽浸出物10g/l，溶剂为水，121℃高压灭菌20min。固体培养基加入1.5％琼脂。

22、所述种子培养基的成分及配制方法为：

23、蔗糖10.8g/l，淀粉20g/l，胰蛋白胨0.93g/l，酵母浸出物0.86g/l，七水硫酸镁0.5125g/l，尿素0.5g/l，无水磷酸氢二铵0.73g/l，无水氯化钾0.17g/l，硝酸钠0.12g/l，碳酸钙0.43g/l，溶剂为水，115℃高压灭菌20min；

24、所述发酵培养基的成分及配制方法为：

25、葡萄糖23g/l，淀粉15g/l，胰蛋白胨5g/l，酵母浸出物3g/l，七水硫酸镁0.25g/l，酒石酸铵2g/l，无水磷酸二氢钾1g/l，硝酸钙0.4g/l，溶剂为水，115℃高压灭菌20min。

26、进一步地，所述方法得到的木霉菌素产量为1.6g/l，相比于出发菌株提高了77.8％。

27、本发明取得的有益效果为：

28、1、本发明基因工程菌株过表达乙酰基转移酶基因tri3和细胞色素p450加氧酶tri11,大大提高了木霉菌素产量,本发明大大提高了木霉菌素产量,减少了下游分离纯化木霉菌素过程中分成本,为工业化生产紫杉木霉提供了优良菌株。本发明显著地提高了紫杉木霉发酵生产木霉菌菌素的产量,提高了菌株发酵效价,增加了稳定性,为微生物发酵法制备木霉菌素提供了优良菌种。本发明克服了现有技术中现有紫杉木霉发酵生产木霉菌素过程中,菌株发酵效价较低,稳定性较差,造成后续木霉菌素纯化工艺成本提高且无法进行工业化生产。

29、2、本发明紫杉木霉菌株能够应用在木霉菌素生产方面中,该菌株于摇瓶发酵条件下7天，通过hplc分析得知tri3基因和tri11基因共过表达菌株m1的木霉菌素产量为1.6g/l,相比宿主菌株的0.9g/l提高了77.8％。

30、3、本发明中将tet-on调控cre表达的由北京华大基因合成的质粒plh472(tet-on-cre,hph，seq idno.5)转化至紫杉木霉野生型菌株zjuf0986,经转化子筛选和潮霉素抗性基因重组，获得可以用强力霉素诱导表达cre的高产木霉菌素的紫杉木霉基因工程菌株的宿主菌s2531。因此可以实现对loxp-hph-loxp元件中潮霉素抗性基因hph的重组去除,从而可以反复使用hphmarker实现连续的对多个基因的过表达或敲除。

31、4、本发明所用的宿主菌株是紫杉木霉菌株s2531,高产木霉菌素的紫杉木霉基因工程菌株m1是在紫杉木霉菌株s2531的基础上共过表达了乙酰基转移酶基因tri3和细胞色素p450加氧酶基因tri11的紫杉木霉菌株。

32、5、本发明以紫杉木霉为底盘细胞，通过分析木霉菌素合成网络中的代谢关键点，利用基因组编辑技术和大片段dna组装技术对木霉菌素合成相关功能模块进行强化及调控，构建高产木霉菌素的细胞工厂，实现木霉菌素的高效绿色生物制造。