SPAST的剪切突变体及其应用的制作方法

本发明涉及基因，尤其涉及spast的剪切突变体及其应用。

背景技术：

1、遗传性痉挛性截瘫(hsp，又称strümpell-lorrain综合征)是一种罕见的遗传异质性神经退行性疾病，根据民族人群的不同，患病率为4.3-9.8/10万。临床表现主要为进行性痉挛性步态、双下肢静止肌张力增加、肌腱反射亢进、踝关节阵挛性痉挛、病理体征阳性、重症肌无力。可能伴有膀胱直肠功能异常，踝关节振动丧失，爪足，脊柱侧弯。hsp可以在35岁之前(早期发病)或35岁之后(经典发病)开始，根据1981年和1983年哈丁提出的标准，根据体征和症状可分为单纯(无并发症)和复杂(复杂)。单纯形式局限于进行性痉挛性麻痹，临床表现局限于皮质脊髓系统退行性变，包括下肢无力和痉挛，皮质脊髓束体征，振动感和本体感觉障碍，以及可变高渗尿障碍。复杂hsp伴有额外的神经体征，包括智力迟钝、小脑性共济失调、智力缺陷、癫痫、周围神经病、视神经萎缩、色素性视网膜炎、神经系统功能障碍，以及其他锥体外特征，如神经性耳聋、白质病变(wml)和胼胝体薄(tcc)。

2、到目前为止，spast基因突变是引起hsp最常见的原因。spast基因位于2p24-p21上，包含17个外显子，编码616氨基酸蛋白，是aaa atp酶蛋白家族的一员，在轴突转运中发挥重要作用，调节微管组织。在不同人群中，约40％的非复杂常染色体显性hsp病例和10％的散发性hsp病例中发现spast突变。迄今为止，已在spast基因中鉴定出500多个突变(http://www.hgmd.cf.ac.uk)。由spast突变引起的hsp病例通常表现为简单的疾病形式，通常与下肢振动感知下降和泌尿系统问题有关。然而，即使在同一家庭中，发病年龄、症状严重程度和症状进展也有很大差异。

3、因此，有针对性的对hsp开展遗传学研究，明确致病基因及其致病机制，对hsp患者的遗传咨询和个体化防治具有潜在的临床意义，为hsp早期诊断和有效治疗提供研究方向和新的理论依据，也将在实践上为研发治疗hsp的特效药物提供新的分子靶点。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供spast的剪切突变体及其应用，主要为了弥补现有技术中对于spast的研究还存在的空白，同时为痉挛性截瘫的治疗提供新的治疗方案。

2、为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面涉及核酸，包括含下列目标片段，

4、所述目标片段与序列为seq id no：1的野生型spast基因相比，具有c.1173+1_1173+2dup突变。并不局限于除c.1173+1_1173+2dup突变外序列其他位点必须与seq id：no.1一致。

5、在前述基础上，所述核酸的类型包括dna、rna或cdna，核酸的类型不做具体的限定，只要其与野生型spast基因相比具有指定的突变，则应当认定其为本条范围内的核酸。

6、本发明第二方面涉及多肽，与序列为seq id no：2的野生型spast编码的多肽相比，所述多肽具有具有第8号外显子跳跃突变。同样的，并不局限于除具有第8号外显子跳跃突变突变外序列其他位点必须与seq id：no.2一致。

7、本发明第三方面涉及生物模型在筛选药物中的应用，所述生物模型至少携带下列之一：

8、a.核酸，与序列为seq id no：1的野生型spast基因相比，具有c.1225g>c、c.1742g>c、c.1173+1_1173+2dup突变；

9、b.多肽，与序列为seq id no：2的野生型spast蛋白多肽相比，具有具有第8号外显子跳跃突变；

10、所述生物模型为细胞模型。该细胞模型的一种应用方式为进行规模化的药物筛选，可以通过药物对细胞模型进行作用，验证该药物是否具有抑制相应突变的作用，并可据此进一步验证该药物是否可以通过抑制突变实现治疗相应的疾病，比如通过该细胞模型即可实现模拟痉挛性截瘫的疾病环境、然后进一步通过该模型实现体外验证部分药物的作用。在本条中，主要考虑的筛选因素是针对相应的突变，暂不具体限定药物的具体治疗对象，该种应用方式主要在药物研发过程中进行使用。其中，所述药物为治疗痉挛性截瘫的药物；痉挛性截瘫主要是由前述突变导致。更具体的，所述药物为治疗痉挛性截瘫4型的药物。由此，通过本生物模型实现了对一些作用效果未知的物质进行筛查，方便进一步研究该物质是否具有用于治疗痉挛性截瘫的预期。

11、本发明第四方面涉及检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用，所述试剂盒或设备用于筛查或诊断痉挛性截瘫；其中：

12、所述核酸与野生型spast基因相比，具有c.1225g>c、c.1742g>c、

13、c.1173+1_1173+2dup突变中至少一种；所述多肽与野生型spast蛋白相比，具有第8号外显子跳跃突变。针对不同位点的检测试剂进行组合使用，通过对探针引物的合理设计，可以提升筛查效率和准确度，主要的有效探针、引物均可视为包括本文已经公开与相应位点对应的。只要相应的产品应用到了能够检测前述四种spast突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。筛查痉挛性截瘫主要是患病风险排查，便于提前干预；诊断则是对于已经患病的人员进行辅助诊断，当然是否已经患病是以患者机体实际变化为准，不以人的主观认知干预。

14、针对检测核酸和/或多肽的试剂，试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。具体为试剂包括特异性检测核酸的产品，还包括特异性检测多肽的产品，该产品至少可为抗体、探针、引物以及质谱检测试剂中任一，同时还可为其他具有相似功能的试剂。另外，试剂盒的形式可为一些与现有产品类似的试剂盒，设备则可为一些序列检测设备。引物和探针均可选择其中任一，也可根据需要进行组合使用。

15、更为具体的，所述引物包括序列如下的引物对：

16、引物对1：正向引物：5'ttcaagcaattctgccacg3'

17、反向引物：5'tctggtggcttgctggc3'，

18、引物对2：正向引物：5'attgcctggactctgtgaacc3'

19、反向引物：5'catcggctacagaaacagcct3'，

20、引物对3：正向引物：5'agctatgggcagctctgttt3'

21、反向引物：5'agactcaaggacaagataaagtttc3'；

22、优选的，当所述痉挛性截瘫为痉挛性截瘫4型。制备所得的相应检测产品不仅可以用于筛查和诊断痉挛性截瘫，同时可以更为精准的筛查易感痉挛性截瘫4型人群，还可对痉挛性截瘫4型患者进行诊断，相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，同时前述探针、引物在进行相应检测过程中具有更好的效果。

23、本发明第五方面涉及筛选痉挛性截瘫生物样品的试剂盒，包含有能检测spast基因突变体的试剂；

24、与序列为seq id no：1的野生型spast基因相比，所述spast基因突变体具有c.1173+1_1173+2dup突变，或

25、与序列为seq id no：2的野生型spast相比，所述spast基因突变体具有具有第8号外显子跳跃突变；

26、在该种情况下，只要相应的产品应用到了能够检测前述四种spast突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。

27、其中，所述试剂为核酸探针或引物。

28、相应的检测试剂可为引物和探针，所述引物包括序列如下的引物对：

29、引物对：正向引物：5'agctatgggcagctctgttt3'

30、反向引物：5'agactcaaggacaagataaagtttc3'。

31、优选的，痉挛性截瘫生物样品为痉挛性截瘫4型样品；该种样品的主要来源为疑似患者，比如患者的外周血、皮肤、皮下组织等。相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，可以更快速的“无创”检查。试剂盒也应当做宽泛的解释，还包括一些检测试纸、设备等。

32、本发明第六方面涉及特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗痉挛性截瘫；其中，所述核酸与野生型spast基因相比，具有c.1225g>c、c.1742g>c、c.1173+1_1173+2dup突变。所述试剂至少为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂，当然还可基于其他具有相似功能的物质。如crisprs技术是一种由rna指导cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，rispr-cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于crispr-cas9的方法，可以设计出sgrna并合成该序列的grna，然后将grna与dcas9在细胞中共表达，通过grna介导dcas9蛋白与目标dna区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，恢复蛋白功能，相应的编辑技术均已是常规现有技术，在此不做赘述，当然所有项目的实施都必须依法施行。在本条中，主要修复的特定位点就是spast基因的c.1225g>c、c.1742g>c、c.1173+1_1173+2dup的突变位点。优选的，所述痉挛性截瘫为痉挛性截瘫4型，通过针对性进行用药，使得相应的致病基因修复，实现疾病的预防和治疗。

33、本发明第六方面涉及构建体和重组细胞：

34、构建体，包含前述公开的核酸，核酸与序列为seq id no：1的野生型spast基因相比，具有c.1173+1_1173+2dup突变。构建体同样可以在制药过程中作为药物作用效果的检验模型。

35、重组细胞，所述重组蛋白是通过前述构建体转化受体细胞获得。

36、

37、

38、需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以burrows wheeler测序平台内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。

39、本发明的有益效果是：

40、为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的重复型突变与痉挛性截瘫疾病的联系，并据此为痉挛性截瘫的治疗提供新的治疗方案，尤其是为痉挛性截瘫4型提供了诊断治疗的手段。