双链环化文库及其构建方法和应用与流程

本发明属于基因测序领域，具体涉及双链环化文库及其构建方法和应用。

背景技术：

1、二代测序(ngs)又称为高通量测序，是基于pcr和基因芯片发展而来的dna测序技术。二代测序在dna复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记(一般为荧光分子标记)来确定dna的序列。由于在二代测序中，单个dna分子必须扩增成由相同dna组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出dna序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长(不超过500bp)。因此，二代测序具有建库时间长，文库长度短的缺点。三代测序中的纳米孔(nanopore)测序技术，其原理是蛋白纳米孔(微型小孔，本征上是在膜上形成通道)嵌入合成膜，并浸没在离子溶液中，使离子电流通过纳米孔。当dna或rna链通过纳米孔时，会对电流产生干扰，引起电流信号的改变，且不同的碱基会引起不同的电流信号变化。因此，与基于光信号的测序技术不同，nanopore测序技术通过解码核酸通过蛋白纳米孔时的电流信号来确定碱基序列。该测序技术的全长转录组平均读长为1～1.5kb，测序速度快；但是每次只通过一个碱基，导致单个样本只能被读取1～2次，容易造成测序的准确率降低。

2、因此，有必要提供一种构建较长文库的方法，且通过该方法构建的文库用于测序时能提高测序的准确度。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种双链环化文库的构建方法，能够构建出长度为200～8000nt的双链环化文库，可用于长读长测序，且可以提高测序的准确度。

2、本发明还提出根据所述构建方法构建的双链环化文库。

3、本发明还提出了一种长片段dna的测序方法。

4、根据本发明的一个方面，提出了一种双链环化文库的构建方法，包括以下步骤：

5、s1：对目标dna进行打断、末端修复和接头连接，得连接产物；

6、s2：对步骤s1所述连接产物进行pcr扩增，得扩增产物；

7、s3：使用尿嘧啶特异性切除试剂在所述扩增产物的尿嘧啶位置切割，得包含缺口的消化产物；将所述包含缺口的消化产物与连接酶混合，孵育后得所述双链环化文库；所述双链环化文库的长度为200～8000nt。

8、根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

9、本发明的构建方法可以减少拼接成本，节省内存和计算时间；同时避免了pcr扩增时引入错误。根据本发明方法构建的双链环化文库的长度可达200～8000nt，从测序应用上来看，属于长读长测序。基于此，本发明构建的双链环化文库可以通过滚换复制多次扩增，实现单一样本的多次测序，从而可以提高测序的准确度。

10、在本发明的一些实施方式中，步骤s1所述目标dna为基因组dna。

11、在本发明的一些实施方式中，步骤s1所述打断后得到的dna的长度为1～2kb。

12、在本发明的一些实施方式中，步骤s1在所述打断结束后，还包括纯化打断后dna的步骤。

13、具体地，所述纯化的方法包括磁珠法、硅胶层析柱法、沉淀法中的任何一种。

14、更具体地，所述纯化选择磁珠法。

15、后续纯化的方法与这里相同。

16、在本发明的一些实施方式中，步骤s1所述末端修复的方法包括：将打断后dna与第一末端修复体系混合，于20～25℃下加热30～40min，得第一末端修复dna。

17、具体地，所述第一末端修复体系包括：tris-hcl、mgcl2、dtt、atp、dntps、t4dna聚合酶、t4多核苷酸激酶和bsa。

18、更具体地，所述第一末端修复体系包括：50mm的tris-hcl，10mm的mgcl2，10mm的dtt，1mm的atp，0.4mm的dntps，0.08u/μl的t4 dna聚合酶，0.2u/μl的t4多核苷酸激酶，0.11mg/ml的bsa。

19、在本发明的一些实施方式中，步骤s1所述末端修复的方法还包括：将所述第一末端修复dna与第二末端修复体系混合，于35～37℃下加热30～35min，得末端修复dna。

20、具体地，所述第二末端修复体系包括：反应缓冲液、datp和dna聚合酶klenow。

21、更具体地，所述第二末端修复体系包括：10×反应缓冲液，0.25mm的datp，0.2u/μl的dna聚合酶klenow。

22、在本发明的一些实施方式中，步骤s1在每一步所述末端修复之后，包括对所述第一末端修复dna和所述末端修复dna进行纯化的步骤。

23、在本发明的一些实施方式中，步骤s1将所述末端修复dna与接头混合，经连接缓冲液将所述接头与所述末端修复dna连接，得所述连接产物。

24、在本发明的一些实施方式中，所述接头包括第一接头和第二接头。

25、在本发明的一些实施方式中，所述第一接头包括p1序列和p2序列，所述p1序列的核酸序列如seq id no:1(agcucgcgagcgguacagtcagtac)所示，所述p2序列的核酸序列如seq id no:2(gtactgactgtaccgctcgcgagct*t*t，其中*代表磷酸化位点)所示。

26、在本发明的一些实施方式中，所述第二接头包括p3序列和p4序列，所述p3序列的核酸序列如seq id no:3(ccgcucgcgagcutgacga)所示，所述p4序列的核酸序列如seq idno:4(tcgtcaagctcgcgagcgg*t*t，其中*代表磷酸化位点)所示。

27、具体地，第一接头和第二接头的磷酸化位点是接头与双链dna连接的必然要求。

28、在本发明的一些实施方式中，所述连接缓冲液包括：peg-8000、ph 7.8的tris-hcl、atp、bsa、mgcl2、dtt和t4 dna连接酶。

29、在本发明的一些优选的实施方式中，所述连接缓冲液包括：30％的peg-8000，150mm、ph 7.8的tris-hcl，3mm的atp，0.15mg/ml的bsa，30mm的mgcl2，1.5mm的dtt，30u/μl的t4 dna连接酶。

30、在本发明的一些实施方式中，步骤s1在所述接头连接后，还包括对接头连接产物进行纯化的步骤。

31、在本发明的一些实施方式中，步骤s2在完成所述pcr扩增后，还包括对所述扩增产物进行纯化的步骤。

32、在本发明的一些实施方式中，所述尿嘧啶特异性切除试剂包括user enzyme、userⅱenzyme、userⅲenzyme、uracil dna glycosylase、dna glycosylase-lyaseendonucleaseⅷ中的至少一种。

33、在本发明的一些优选的实施方式中，所述尿嘧啶特异性切除试剂选择userenzyme。

34、在本发明的一些实施方式中，步骤s3所述孵育的温度为25～30℃，时间为60～70min。

35、在本发明的一些优选的实施方式中，步骤s3所述孵育的温度为25℃，时间为60min。

36、在本发明的一些实施方式中，步骤s3在制得所述双链环化文库后，还包括消化未成环模板的步骤：向包含所述双链环化文库的体系中加入消化缓冲液，于35～40℃加热60～65min，并使用edta终止反应。

37、在本发明的一些实施方式中，所述消化缓冲液包括：plasmid-safe 10×reactionbuffer，25mm的atp，plasmid-safe atp-dependent dnase。

38、在本发明的一些优选的实施方式中，所述构建方法还包括步骤s4：将所述双链环化文库与测序引物、具有链置换功能的dna聚合酶混合进行滚环复制，以验证所述双链环化文库的质量。

39、在本发明的一些实施方式中，所述具有链置换功能的dna聚合酶为phi29 dna聚合酶。

40、根据本发明的第二个方面，提出了根据所述构建方法构建的双链环化文库。

41、根据本发明的第三个方面，提出了一种长片段dna的测序方法，以所述双链环化文库为对象进行测序。