一种阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法。

背景技术：

1、苯丙烯酯是以苯丙烯酸作为酰基供体、以醇、硫醇、胺类作为酰基受体生成的酯类衍生物。苯丙烯酯在兼具苯丙烯酸的抗氧化、抗炎生理活性，与醇、硫醇、胺类的生物活性的同时，具有比苯丙烯酸更好的水溶性或脂溶性，更易于在特定的生物环境中发挥生理功能。以苯丙烯酸中的阿魏酸为例，研究表明，阿魏酸衍生物比阿魏酸具有更强的药理活性和较低的毒性[1,2]。相比阿魏酸，阿魏酸芳香酯具有更好的脂溶性，阿魏酸芳香酯具有抗高血糖、抗氧化、抗炎、预防癌症的作用。阿魏酸糖酯比阿魏酸水溶性好，并具有抗菌、抗氧化、抗糖基化、调节肠道微生态以及保护血管，有效控制糖尿病发生发展的生物活性，例如，6-o-阿魏酰葡萄糖酯抗氧化活性高于阿魏酸。阿魏酸酰胺可以降血压、抑制乙酰胆碱脂酶和促进胰岛素分泌，其对乙酰胆碱酯酶的抑制活性高于阿魏酸。

2、苯丙烯酯可以从天然植物中提取获取，然而天然植物成分复杂，所获产物需要经过复杂的提纯步骤。例如，阿魏酸低聚糖酯即是通过加入阿魏酸酯酶水解半纤维素，酶解产物经过进一步纯化得到。

3、除了天然产物提取法，苯丙烯酯还可以通过化学合成法和酶促合成法获取，多是非水相合成。以阿魏酸苄酯为例，其化学合成法需要两步，通过将阿魏酸催化成阿魏酸酰氯后与苯甲醇反应合成阿魏酸苄酯，整个反应过程均在有机溶剂中进行，但有机溶剂的大量使用并不经济环保。酶促合成法可以利用的酶有脂肪酶、阿魏酸酯酶、阿魏酸酰基转移酶、羧酸还原酶。其中，脂肪酶需要在无溶剂体系或有机溶剂体系中催化阿魏酸酯合成。阿魏酸酯酶在含水量1-5％的微乳体系中酶促合成阿魏酸烷基酯和阿魏酸糖酯。目前已经报道可用于水相合成苯丙烯酯的例子仅有两个，第一个是通过阿魏酸酰基转移酶，通过复杂昂贵的辅酶a底物水相酶促合成，第二是羧酸还原酶在水相中利用昂贵辅因子atp合成苯丙烯酯。

4、因此，有必要针对非水相酶催化存在的对有机溶剂的依赖性问题，以及现有水相催化中使用昂贵复杂辅因子的问题，开发一种新型绿色环保、经济的苯丙烯酯合成方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，

2、本发明的技术方案是：提供一种阿魏酸酯酶amce1，其氨基酸序列如seq id no 2所示，所述阿魏酸酯酶来源于anaeromyces mucronatus。

3、一种阿魏酸酯酶amce1，其氨基酸序列如seq id no 2中经以下至少一种突变情况所得：

4、将第64位的甘氨酸g突变为丙氨酸a；

5、将第64位的甘氨酸g突变为脯氨酸p；

6、将第64位的甘氨酸g突变为异亮氨酸i；

7、将第65位的亮氨酸l突变为丙氨酸a；

8、将第67位的丝氨酸s突变为丙氨酸a；

9、将第67位的丝氨酸s突变为异亮氨酸i；

10、将第155位的苯丙氨酸f突变为丙氨酸a；

11、将第156位的丝氨酸s突变为半胱氨酸c；

12、将第224位的缬氨酸v突变为丙氨酸a；

13、将第225位的缬氨酸v突变为丙氨酸a；

14、将第254位的天冬氨酸d突变为丙氨酸a；

15、将第254位的天冬氨酸d突变为异亮氨酸i；

16、一种阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以苯丙烯甲酯或苯丙烯乙酯作为酰基供体，以带有苯环、萘基的醇类及直链脂肪醇作为酰基受体，在阿魏酸酯酶的催化下，反应生成苯丙烯酯；催化反应的温度为20～55℃；催化反应体系中除去底物和阿魏酸酯酶，余量为水或磷酸盐或tris-hcl缓冲液，反应体系中可选择加入或不加入用于溶解底物的助溶剂；所述催化反应体系的ph值为3～11；所述催化反应体系转速为0-220rpm；

17、反应步骤为：

18、(1)异源表达并获得阿魏酸酯酶amce1

19、异源表达并获得阿魏酸酯酶amce1

20、用于发酵制备催化酶的阿魏酸酯酶amce1的基因序列如seq id no.1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示，由金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，基因合成后与表达载体pet-30a(+)连接，转化到e.coli bl21(de3)中进行蛋白质的表达，用卡那霉素抗性的培养基筛选转化成功的表达菌株，扩大培养后，转入摇瓶培养，将重组菌株按5％的添加量加入含卡那霉素的lb液体培养基中，在220rpm、37℃条件下培养。待od600为0.5至0.6时，加入中浓度为1mm的iptg，在20℃、220rpm条件下诱导表达20小时，6000rpm、10min离心收集菌体，使用20ml 50mm ph7.4 pbs重悬菌体，360kw超声破胞40min后12000rpm、30min离心去除细胞碎片，取上清液使用0.22μm滤膜过滤后作为粗酶保存在-20℃后续备用。

21、重组amce1在其氨基末端被6his标签标记，因此纯化简单地使用(ni-nta)亲和柱层析,具体方法如下。将上清液直接加载到ni-nta亲和柱中，并用两倍体积的洗涤缓冲液[3.8mm nah2po4，16.2mm na2hpo4，500mm nacl和10mm咪唑(ph 7.4)]洗涤柱。用洗脱缓冲液[3.8mm nah2po4，16.2mm na2hpo4，500mm nacl和88.4mm咪唑(ph7.4)]洗脱结合在柱上的重组amce1，并将来自洗脱部分的蛋白质透析以除去过量的咪唑。纯化的重组amce1通过sds-page(含10％(w/v)丙烯酰胺)电泳检测纯度，将纯酶保存在-20℃后续备用；

22、(2)酶促催化

23、在缓冲液中加入酰基供体苯丙烯甲酯或苯丙烯乙酯和酰基受体醇类，加入amce1粗酶或纯酶，催化反应体系中除去底物和阿魏酸酯酶，余量为水或磷酸盐或tris-hcl缓冲液，反应体系中可选择加入或不加入用于溶解底物的助溶剂；催化反应的温度为20～55℃；所述催化反应体系的ph值为3～11；所述催化反应体系转速为0-220rpm，反应后，酰基供体脱去甲醇或乙醇，酰基受体脱去醇上的氢和酰基供体余下的苯丙烯酰基反应，即带有苯环、萘基的醇类及直链脂肪醇取代原本底物中的甲酯或乙酯,生成新的苯丙烯酯。

24、所选的底物为苯丙烯甲酯、苯丙烯乙酯，醇类为带有苯环、萘基的醇类及直链脂肪醇。

25、所述的助溶剂选自1％～10％v/v乙腈、dmso中的一种。

26、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以阿魏酸甲酯为酰基供体，以带有苯基的醇类苯甲醇、苯乙醇、苯丙醇、苯丁醇为酰基受体，催化合成阿魏酸苄酯、阿魏酸苯乙酯、阿魏酸苯丙酯、阿魏酸苯丁酯。

27、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以肉桂酸甲酯、咖啡酸甲酯、反对香豆酸甲酯为酰基供体，苯乙醇为酰基受体，合成肉桂酸苯乙酯、咖啡酸苯乙酯、反对香豆酸苯乙酯。

28、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以反式阿魏酸甲酯为酰基供体，对羟基苯乙醇为酰基受体，合成反式阿魏酸对羟基苯乙酯。

29、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以阿魏酸甲酯为酰基供体，以带有苯基且苯基上有侧链修饰的甲氧基、羟基的醇类作为酰基受体，即对羟基苯乙醇、4羟基3-甲氧基苯甲醇为酰基受体，合成阿魏酸对羟基苯乙酯、阿魏酸4羟基3-甲氧基苯甲酯。

30、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以阿魏酸甲酯为酰基供体，以阿利苯多为酰基受体，合成阿魏酸阿利苯多酯。

31、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以阿魏酸甲酯为酰基供体，以萘乙醇为酰基受体，合成阿魏酸萘乙酯。

32、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以阿魏酸甲酯为酰基供体，以带有苯基的糖苷即苯基-β-d-葡萄糖苷、熊果苷、苯基-β-d-吡喃半乳糖苷为酰基受体，合成阿魏酸苯基-β-d-葡萄糖苷酯、阿魏酸熊果苷酯、阿魏酸苯基-β-d-吡喃半乳糖苷酯。

33、所述的阿魏酸酯酶催化合成苯丙烯酯的方法，以阿魏酸甲酯为酰基供体，以直链醇类丙醇、丁醇、辛醇为酰基受体，催化合成阿魏酸丙酯、阿魏酸丁酯、阿魏酸辛酯。

34、与已有技术相比，本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：

35、1.使用阿魏酸酯酶水相催化合成苯丙烯酯，首次使用阿魏酸酯酶在使用水相体系酶促合成多种苯丙烯酸酯，高效绿色，减少有机试剂的使用。

36、2.步骤简单，避免了繁琐的基团保护和去保护步骤，副产物少，避免复杂的除杂步骤。

37、上述两点均为经过大量实验获取的结果，不具有显而易见性，也不能为本领域技术人员基于已有技术和知识进行推测。