一种自体CIK细胞高效扩增方法与流程

本发明涉及细胞培养，具体为一种自体cik细胞高效扩增方法。

背景技术：

1、cik细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同诱导而获得的一群异质细胞。是在lak细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞，lymphokine-activatedkillercells)的基础上发展起来的新一代细胞因子活化淋巴细胞。lak细胞是1982年grimm等首先报道，在外周血单个核细胞中加入多种细胞因子体外培养4-6天，诱导出的一种非特异性的杀伤细胞，可杀伤多种肿瘤细胞。1984年rosenberg研究组首次应用il-2与lak协同治疗25例肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者，其中11例肿瘤缩小50％，1例黑素瘤完全消退。

2、1988年该研究组总结了协同治疗的222例肿瘤患者，其中16例患者肿瘤转移灶完全消退，26例患者肿瘤消退50％以上，该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤的疗效显著。

3、自体cik细胞培养在临床治疗方面有着非常明显的优势,因为取自患者自身的组织进行培养因此发生疾病交叉感染的风险就会大大的降低,安全性方面有非常大的保证，故需要一种自体cik细胞高效扩增方法。

技术实现思路

1、鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种自体cik细胞高效扩增方法，采用的技术方案是，包括如下步骤：

2、s1、制备培养瓶：向培养瓶中加入活化剂至覆盖瓶底，孵育，得活化培养瓶，所述活化剂由cd3单克隆抗体和ifn-γ溶于pbs缓冲溶液配制而成。

3、s2、外周血单个核细胞的分离：从患者血液中分离外周血单个核细胞，悬浮备用。

4、s3、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25min，收获上清成分，直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用，或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物。

5、s4、配制活化培养基：向49ml含血浆的基础培养基中加入1ml的cik细胞激活剂，得活化培养基。

6、s5、自体cik细胞的培养：将所述外周血单个核细胞小心铺入培养基中培养，培养时补加5％～20％的含有所述血小板聚集释放物的无血清培养基，并添加细胞因子il2、il1a、anti-cd3进行诱导，直至收获所述自体cik细胞。

7、作为本发明的一种自体cik细胞高效扩增方法优选技术方案，所述s1中的活化剂中cd3单克隆抗体浓度为50μg/ml，ifn-γ浓度为2000u/ml。

8、作为本发明的一种自体cik细胞高效扩增方法优选技术方案，所述s1中孵化条件为4℃～37℃，孵育时间为1-18h。

9、作为本发明的一种自体cik细胞高效扩增方法优选技术方案，所述s2中使用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞。

10、作为本发明的一种自体cik细胞高效扩增方法优选技术方案，所述s3中使用的所述磷酸盐缓冲液为含ca2+、mg2+的磷酸盐缓冲液。

11、作为本发明的一种自体cik细胞高效扩增方法优选技术方案，所述s3中二磷酸腺苷为80～150μmol/l。

12、作为本发明的一种自体cik细胞高效扩增方法优选技术方案，所述s4中cik细胞激活剂由il-2、il-1α和ifn-γ溶于pbs缓冲溶液配制而成。

13、作为本发明的一种自体cik细胞高效扩增方法优选技术方案，所述血小板聚集释放物中血小板衍生生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子的含量均大于150ng/g。

14、本发明的有益效果：本发明通过。

技术特征：

1.一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于：所述s1中的活化剂中cd3单克隆抗体浓度为50μg/ml，ifn-γ浓度为2000u/ml。

3.根据权利要求1所述的一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于：所述s1中孵化条件为4℃～37℃，孵育时间为1-18h。

4.根据权利要求1所述的一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于：所述s2中使用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞。

5.根据权利要求1所述的一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于：所述s3中使用的所述磷酸盐缓冲液为含ca2+、mg2+的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于：所述s3中二磷酸腺苷为80～150μmol/l。

7.根据权利要求1所述的一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于：所述s4中cik细胞激活剂由il-2、il-1α和ifn-γ溶于pbs缓冲溶液配制而成。

8.根据权利要求1所述的一种自体cik细胞高效扩增方法，其特征在于：所述血小板聚集释放物中血小板衍生生长因子、转化生长因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子的含量均大于150ng/g。

技术总结
本发明公开了一种自体CIK细胞高效扩增方法，包括S1、制备培养瓶：向培养瓶中加入活化剂至覆盖瓶底，孵育，得活化培养瓶，所述活化剂由CD3单克隆抗体和IFN‑γ溶于PBS缓冲溶液配制而成。S2、外周血单个核细胞的分离：从患者血液中分离外周血单个核细胞，悬浮备用。S3、血小板聚集释放物的制备：分离获得血小板并用磷酸盐缓冲液重悬，获得重悬血小板；向所述重悬血小板中加入二磷酸腺苷，培养箱孵育培养2～4小时，1800～2000g离心20～25min，收获上清成分，直接作为含有血小板聚集释放物的溶液使用，或者冻干处理即得所述血小板聚集释放物。

技术研发人员：徐子恩,弗莱德·范德里希,胡建杰
受保护的技术使用者：范德里希（上海）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12